正交试验优选十味参归灌肠液的乙醇提取工艺

何艳春，莫秋瑜，黄瑞松

（1.南宁市妇幼保健院，广西 南宁 530011；2.广西民族医药研究院，广西 南宁 530001）

盆腔炎为妇科常见疾病，包括盆腔结缔组织炎、盆腔腹膜炎、子宫炎及输卵管卵巢炎等，发病率高。盆腔炎相当于中医学“带下”“痛经”“癥瘕”等范畴，因热伏胞中，毒邪感染，影响气血运行，致使气血瘀滞、冲任受损而发病。十味参归灌肠液为南宁市妇幼保健院治疗盆腔炎的验方，临床疗效确切。为进一步促进该验方的临床应用，该院拟将其开发为医院制剂，对其制备工艺进行研究。十味参归灌肠液处方由丹参、延胡索、当归等10味中药组成，其中当归等8味药材适合使用水提醇沉工艺，而丹参、延胡索2味药水提取效果不佳。丹参主要有效成分为含二萜类酯溶性及酚酸类水溶性化合物，包括丹参酮ⅡA、丹酚酸B等［1］，延胡索主要有效成分为延胡索乙素，这2味药材所含有效成分均溶于乙醇，故应选用乙醇回流法进行提取。现本文对十味参归灌肠液的醇提工艺进行研究，以丹酚酸B和延胡索乙素得率作为考核指标，采用正交试验法对可能影响丹酚酸B、延胡索乙素得率的药材粉碎度、乙醇浓度、乙醇用量、回流次数、回流时间等5个因素进行考察。现将结果报道如下。

1 仪器和材料

1.1 仪器 LC-20AT高效液相色谱仪（岛津公司）；XS205电子分析天平（梅特勒公司）；SB3200DTS双频超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 材料 丹参、延胡索由南宁生源中药饮片有限责任公司提供；丹酚酸B（批号：ES-12020104）由上海亿欣生物科技有限公司提供；延胡索乙素（批号：110726-201112）由中国药品生物制品检定所提供；甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他所用化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 因素水平 选择药材粉碎度、乙醇浓度、乙醇用量、回流次数、回流时间作为影响因素，每个因素取两个水平，选用L8（2）7正交表进行试验，考核指标为丹酚酸B和延胡索乙素的得率。因素水平见表1。

表1 因素水平表

2.2 样品溶液的制备 分别称取延胡索、丹参各1.5 g，精密称定，参照正交试验设计方案（表2）进行乙醇回流提取，滤过，合并滤液，各加入相应浓度乙醇定容至50m l，作为样品溶液。

2.3 丹酚酸B的含量测定

2.3.1 溶液制备 供试品溶液的制备：精密吸取2.2项下样品溶液1.5ml，加相应浓度的乙醇定容至10m l，即得。对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品适量，加75%甲醇制成浓度为0.162mg/ml的溶液，即得。阴性溶液的制备：取缺丹参的样品1.5 g，精密稳定，照2.2项下方法制备成阴性溶液。

2.3.2 测定方法 采用《中华人民共和国药典》2010年版丹参项下的HPLC法［2］70-71测定。色谱条件：色谱柱为菲罗门GeminiC18（4.6mm×250mm，5μm），流动相为甲醇∶乙腈∶甲酸∶水（30∶10∶1∶59），流速为1.0m l/min，检测波长为286 nm，柱温为室温，进样量为10μl。分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性溶液各10μl进样测定，色谱图见图1。结果显示，阴性溶液对测定无干扰。

图1 丹酚酸B含量测定色谱图

2.4 延胡索乙素的含量测定

2.4.1 溶液制备 供试品溶液的制备：取2.2项下样品溶液，即为供试品溶液。对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成浓度为44μg/ml的溶液，即得。阴性溶液的制备：取不含延胡索的样品1.5 g，精密稳定，照2.2项下方法制备成阴性溶液。

2.4.2 测定方法 按照《中华人民共和国药典》2010年版延胡索项下的HPLC法［2］130进行测定。色谱条件：色谱柱为菲罗门GeminiC18（4.6mm×250mm，5μm），流动相为甲醇∶0.1%磷酸溶液（60∶40），流速为1.0m l/min，检测波长为280 nm，柱温为室温，进样量为20μl。分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性溶液各20μl进样测定，色谱图见图2。结果显示，阴性溶液对测定无干扰。

图2 延胡索乙素含量测定色谱图

2.5 正交试验方案与结果 见表2。

结果显示：正交表中各试验序列溶液中，丹酚酸B得率在3.099 8%～3.690 0%之间，影响提取效果的因素顺序为D（回流次数）＞E（回流时间）＞C（乙醇用量）＞A（药材粉碎度）＞B（乙醇浓度），主要的影响因素为提取次数，次要因素为提取时间，5个影响因素之间无显著差异，故可任意组合工艺条件。延胡索乙素得率在0.063 8%～0.082 1%之间，影响提取效果的因素顺序为A（药材粉碎度）＞B（乙醇浓度）＞C（乙醇用量）＞E（回流时间）＞D（回流次数），粉碎度对提取效果影响显著，其次为乙醇浓度。除了D（回流次数）因素以外，其他因素对乙醇回流提取工艺均有显著性差异，最佳组合条件为A2B1C2D1（或D2）E2。经综合分析，乙醇回流提取条件只对延胡索乙素的得率有影响（除回流次数外），而对丹酚酸B的得率无显著影响。故确定最佳提取工艺条件为A2B1C2D1E2，即延胡索粉碎过10目筛、丹参切片为2mm，乙醇浓度为70%，加入乙醇量第一次为药材量的6倍，第二次为5倍，回流提取2次，每次1.5 h。

表2 正交试验方案与结果

2.6 验证试验 按处方的3/10比例取丹参、延胡索各1.5 g药材，精密称定，按正交试验所优选的最佳工艺条件制备成样品溶液，并照相应的方法分别测定丹酚酸B和延胡索乙素的得率。结果见表3。验证试验制备的供试品溶液丹酚酸B的得率为3.663 0%，延胡索乙素的得率为0.089 7%，结果与正交试验的最大得率接近。表明正交试验筛选的最佳乙醇回流提取工艺条件是科学可行的。

表3 验证试验结果

3 讨 论

十味参归灌肠液处方中，丹参为君药，具有活血祛瘀、凉血消痈、安神宁心、排脓、止痛等功效［3］，其有效成分丹参酮ⅡA具有改善血液循环、抗凝抗血栓等药理作用，为活血化瘀的主要有效成分。水提法对丹参酮ⅡA等脂溶性成分的提取效果不佳，醇提法可兼顾丹参脂溶性成分和水溶性成分的提取效果，同时降低生产成本［4-5］。谢静［6］研究表明，以低浓度醇作为溶剂的丹参提取物，丹酚酸B的提取率明显高于以水为溶剂的提取物。延胡索具有活血行气、止痛等功效，其有效成分延胡索乙素具有镇静、镇痛作用［7］，延胡索乙素水提效果极差，使用乙醇回流提取效果好。

本研究以丹酚酸B和延胡索乙素作为考核指标，采用正交试验方法，考察了药材粉碎度、乙醇浓度、乙醇用量、回流次数、回流时间5个因素对十味参归灌肠液乙醇回流提取工艺的影响，并经过验证试验证明，筛选出的最佳工艺条件科学合理，可作为十味参归灌肠液乙醇回流提取的制备工艺条件。