微酸性次氯酸液对屏障设施动态环境杀菌效果的研究*
2020-04-09师长宏
白 冰 师长宏
(空军军医大学实验动物中心,西安 710032)
喷雾杀菌是实验动物屏障设施内进行微生物控制的常用方法,所使用的消毒溶液主要为含氯消毒剂。该类消毒剂主要成分为次氯酸盐。由于其工作浓度高、碱性强,具有易挥发、刺激性气味大、性质不稳定、腐蚀性强等缺点。微酸性次氯酸液作为一种新型含氯消毒剂,其有效氯浓度低,消毒性能优良、且腐蚀性小、极少有刺激性气味[1],近年来颇受关注。本研究所用微酸性次氯酸液残留低,与有机物接触可瞬间杀菌、瞬间失活,即使吸入也无毒性。消毒时由于使用的是超微粒子的喷雾,不会润湿皮肤和眼睛。为检测该消毒液及其喷雾在屏障设施内的杀菌效果,实验选取动态饲养环境,进行单次和连续消毒,以获取屏障设施内最优微生物控制方案。
1 材料与方法
1.1 材料
NDX-1500PLB型微酸性次氯酸液生成器由OSG株式会社生产。生产能力70 L/h,功率为3 600 W,生产工艺见图1。标准菌株金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC6538)菌株,沙门菌(Saimonella,ATCC13311)菌株,均购自ATCC。营养琼脂平板由本实验室制备。细菌悬液制备,按《中华人民共和国药典》2015版四部无菌检查法和微生物限度检查法和刘毅萍法[2-3]。
图1 次氯酸水生产工艺Fig.1 Production process of hypochlorite solution
1.2 检测方法
1.2.1制备细菌悬液,浓度达到1×107cfu/mL,然后将无菌滤纸制成1 cm×1 cm 方形纸片,将制片浸入菌液中放置10 min,后取出制片晾干制成菌片备用。吸取消毒剂5.0 mL于无菌小平皿内,将其置(20±1)℃水浴中5 min后,用无菌镊子夹入一菌片,并使浸透于消毒液中。待作用至试验预定的时间,立即用无菌镊子取出菌片移入含5.0 mL稀释液试管中,作用10 min。用电动混合器混合20 s,或将试管振打,吸取该最终样液1.0 mL,接种于营养琼脂平板中,(36±1)℃恒温培养箱培养24~48 h后菌落计数,并计算杀菌率[4],每组实验重复3次。
1.2.2微酸性次氯酸液有效氯含量和pH值等理化指标检测参照文献[4]。
1.2.3检测微酸性次氯酸液对金黄色葡萄球菌和沙门菌杀灭作用。
1.2.3.1 模式Ⅰ:用微酸性次氯酸液喷雾设备对选取的屏障设施进行喷雾杀菌,单次工作15 min,30 min后不同时间点使用营养琼脂平板检测落下菌数,并计算杀菌率,每组实验重复3次。
1.2.3.2 模式Ⅱ:用微酸性次氯酸液喷雾设备对选取的屏障设施进行连续喷雾杀菌,每日工作6次,每次工作5 min,休息5 min,每日连续工作1 h,30 min后不同时间点检测落下菌数,连续工作21 d,每隔7 d检测落下菌数并计算杀菌率,每组实验重复3次。
1.2.3.3 模式Ⅲ:用酸化水对选取的屏障设施进行连续喷雾杀菌,每日工作2次(上、下午各一次),每次连续工作30 min、连续工作21 d,每隔7 d检测落下菌并计算杀菌率,每组实验重复3次。
1.2.4实验选取的屏障设施为:5.6 m×6.0 m×2.5 m=84.0 m3;温度为23.1 ℃,相对湿度为56.3%;小鼠饲养数量为500只,开放饲养。
1.3 杀菌率计算
在微生物杀灭实验中,杀菌率(killing rate,KR)用百分率表示微生物被杀灭的数量,用于评价杀菌效果。实验组菌落数B1(cfu),对照组菌落数B2(cfu),按照下列公式计算KR:
2 结果
2.1 酸化水理化检验结果
有效氯含量为6.84×10-2g/L,pH值为6.24。
2.2 微酸性次氯酸液的杀菌率
微酸性次氯酸液对金黄色葡萄球菌和沙门菌作用15 min后的杀菌率可达到90%以上,见表1和图2。
表1 对标准株的消杀结果Table 1 Sterilization result for standard bactericidal strain
图2 微酸性次氯酸液对金黄色葡萄球菌和沙门菌平板菌落的影响Fig.2 Effect of microacid hypochloric acid on bacterial result of Staphylococcus aureus and Salmonella
2.3 模式Ⅰ检测结果
用微酸性次氯酸液喷雾设备单次工作15 min 后在2 h内杀菌率维持在90%,48~72 h杀菌率低于30%(表2和图3)。
表2 模式Ⅰ空气落下菌杀菌结果(喷雾15 min)Table 2 Sterilization results of mode Ⅰ air fall bacteria (sprayed for 15 min)
2.4 模式Ⅱ检测结果
21 d后杀菌率达到60%以上(表3和图4)。
表3 模式Ⅱ空气落下菌杀菌结果Table 3 Sterilization results of mode Ⅱ air fall bacteria
图4 模式Ⅱ不同时间点落下菌数Fig.4 The number of mode Ⅱ air fall bacteria at different time
2.5 模式Ⅲ检测结果
杀菌率可达到90%以上,见表4和图5。
表4 模式Ⅲ空气落下菌杀菌结果Table 4 Sterilization results of mode Ⅲ air fall bacteria
图5 模式Ⅲ不同时间点落下菌数Fig.5 The number of mode Ⅲ air fall bacteria at different time
3 讨论
含氯消毒剂广泛应用于实验动物屏障设施的日常消毒,通常是雾化后通过沾湿墙面的附着菌进行杀菌,属于迟效性杀菌,并且会呈大颗粒状浮游于室内。而当人进入房间后,会吸入大量的消毒剂或是附着于皮肤上或进入眼睛引起不适,对动物也会产生同样的危害,其毒性和残留性是在使用过程中存在的主要问题。因此,在确保屏障设施消毒效果的基础上,寻求高效、安全、可靠的消毒剂具有重要意义。
本实验选用的微酸性次氯酸消毒液残留性低、有瞬间杀菌力,与有机物接触会瞬间杀菌、瞬间失活,低浓度条件下即使吸入也无毒性。同时,为减少次氯酸残留并进一步提高消毒液的安全性[5],将其分子结构中的次氯酸离子变为次氯酸分子。但消毒液喷雾后呈雾状漂流在室内,若雾中的次氯酸分子不与空中浮游菌接触则部分会气化蒸发,失去作用。为减少气化并提高次氯酸分子的比例,需要将液体pH值控制在7.0 以下。当液体pH值在5~6.5时溶液中次氯酸分子的比例高达90%以上,此时溶液的杀菌效果最好[6]。本实验使用的消毒液pH值为6.24,这也是其具有较强杀菌效果的主要原因。
实验中选取两种标准菌株模拟墙壁和器物表面附着的细菌,进行直接杀菌效果检测。结果显示,消毒液在15 min内能有效杀灭细菌,杀菌率可达到90%以上,表明消毒液在短时间内对物体表面细菌具有良好的杀菌能力,可作为屏障设施的特效杀菌剂。为进一步检测其对屏障设施内空气落下菌的杀菌效果,分别进行单次和连续杀菌效果检测,以获取单次杀菌后的最长维持时间和最佳杀菌时间。结果表明,单次喷雾工作后2 h内,杀菌率可维持在90%以上,超过48 h菌落数与对照无差异。而每日单次工作1 h,连续工作21 d,杀菌率也只能达到60%以上。为了提高杀菌率,实验将杀菌次数改为每日两次,每次持续工作30 min, 21 d后杀菌率可达到90%以上。以上结果充分说明,消毒液能有效杀灭屏障设施内的细菌,但需要进行长期连续的杀灭,并且要尽可能做到高频次,这样才能减少设施内动物感染的机率。如果在杀菌过程中出现间隔,最好控制在48 h之内,超出该时间点后细菌数量会有明显恢复。虽然该消毒液对人及动物无害,但有研究表明其对碳钢、铜为中度腐蚀,对铝为轻度腐蚀,由于对金属有轻度或中度腐蚀作用[7],因此在屏障设施内使用时应尽量避免对上述金属直接作用。另有研究表明,其对芽孢的杀灭取决于所在载体不同而有所差异[7],因此,制定杀灭策略时要根据不同环境进行有针对性的调整,才能收到预期效果。实验中所使用的喷雾设备也得到了充分的检测,证明其完全符合实验动物设施杀菌要求。虽然消毒液不能100%杀灭环境中的细菌,但其可靠性和高效率是明确的,尤其对实验动物屏障设施内微生物控制具有良好的作用,也为其他实验室的消毒提供了参考方案。