和血明目片对激光诱导小鼠脉络膜新生血管的治疗作用*

张宇飞 宋俊伯 危冬昱 龙 盘 李曼红 高锦成 周 健 陈 涛 张作明

(1. 空军军医大学航空航天临床医学中心，西安 710032)(2. 空军军医大学基础医学院，西安 710032)(3. 中国人民解放军西部战区总医院眼科，成都 610083)(4. 空军军医大学第一附属医院西京医院眼科，西安 710032)(5. 陕西省中医医院，西安 710082)

脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)相关疾病是目前眼科领域内主要的致盲性疾病之一，主要以病理性增殖性新生血管形成为特征，易患人群十分广泛，是目前亚洲地区甚至发达国家致视力损伤的主要疾病之一[1-3]。目前临床上对CNV相关疾病的治疗还缺乏较为有效的方法，主要采用抗VEGF治疗、激光光凝、光动力治疗、经瞳孔温热疗法等对症缓解治疗[4-7]。随着国内外中医药研究的发展，发现越来越多的中医药在许多难以攻克的疾病上有着良好的治疗效果[8]，已有研究表明许多中药对CNV相关疾病也有着一定的疗效[9]。和血明目片作为眼科常用的中成药之一，被广泛用于临床治疗糖尿病视网膜病变、高血压眼底出血和年龄相关性黄斑变性等眼科血管性疾病[10-11]。但是，目前尚缺乏相关动物实验基础及相应机制研究证据。因此，本实验旨在从动物实验角度出发研究和血明目片对CNV 的治疗效果，为下一步开展机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康8周龄雄性C57BL/6小鼠30只，空军军医大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK(军)2017-0045，实验动物生产许可证号：SCXK(军)2017-0021，SPF级环境下常规饲养，提供充足饮食，明暗交替12 h /12 h。实验动物的饲养和使用符合视觉与眼科研究协会制定的科研动物使用规范。

1.2 药物与试剂

和血明目片(西安碑林药业股份有限公司)；戊巴比妥钠、FITC标记凝集素(美国Sigma公司)；陆眠宁(吉林省华牧动物保健品有限公司)；荧光素钠注射液(广州白云山明兴制药有限公司)；复方托吡卡胺滴眼液、加替沙星眼用凝胶(沈阳兴齐眼药股份有限公司)；盐酸奥布卡因滴眼液(参天制药有限公司)。

1.3 主要仪器

视觉电生理检查仪(德国罗兰)；同步共焦激光眼底荧光造影仪(德国海德堡)；577 nm倍频Nd：YAG 激光器(美国科医人)。

1.4 方法

1.4.1动物分组：动物适应3 d后进行随机分组，分为对照组、生理盐水组、小剂量组、中剂量组和大剂量组，每组6只。

1.4.2CNV造模方法：小鼠常规腹腔注射麻醉(3 mL/kg、1%戊巴比妥钠)，复方托吡卡胺滴眼液散瞳后，在裂隙灯下通过角膜接触镜将倍频577 nm Nd：YAG激光(能量180 mW、光斑100 μm、曝光时间100 ms)导入眼内，在距离视盘1～2 PD处围绕视盘击射视网膜，每只小鼠双眼击射6个光凝点。光凝后以有小气泡产生为准，可伴轻响或少量出血，表示已经击破Bruch膜。

1.4.3干预及治疗方法：激光造模后第2天开始给药，对照组与生理盐水组10 mL/(kg·d)生理盐水灌胃，小剂量组、中剂量组和大剂量组每日分别给予0.34 g/(kg·d)、0.68 g/(kg·d)、1.36 g/(kg·d)和血明目片灌胃(药物以生理盐水溶解)。

1.4.4视网膜电图(electroretinogram，ERG)记录方法[8]：参照本实验室建立的小动物ERG记录标准化方案对实验动物右眼进行ERG检测。具体方法如下：检测前，将实验动物提前放入小动物暗适应箱中进行12 h暗适应，随后在微弱的红光下进行实验动物常规腹腔注射麻醉(3 mL/kg、1%戊巴比妥钠+50 μL、10%陆眠宁)，复方托吡卡胺滴眼液散瞳，盐酸奥布卡因滴眼液角膜表面麻醉后，安放电极(记录电极为Ag-AgCl角膜环状电极，参考电极为不锈钢颊部针状电极，接地电极为不锈钢尾部针状电极)，随后进行ERG相应指标的记录，记录结束后取下电极，并给予加替沙星眼用凝胶涂眼。

1.4.5荧光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography，FFA)：小鼠行ERG检查后将20%荧光素钠溶液(0.5 mL/kg)自腹腔注入，于注射后1～2 min期间采集FFA图像。荧光素渗漏强度根据Takehana等[12]的实验方法进行分级，分级标准如下：0级为无渗漏、1级为轻度渗漏、2级为中度渗漏、3级为重度渗漏。

1.4.6脉络膜铺片新生血管染色：参照文献[15]报道方法进行脉络膜铺片新生血管染色，具体方法如下：过量麻醉处死小鼠后取出眼球，置于4%多聚甲醛内浸泡1 h，显微镜下以赤道部为界去除前节及神经视网膜层，在脉络膜复合体上作4～6条放射性切口，用自制漂洗液(0.2 mL tween 20，0.5 g BSA，溶于100 mL PBS中)漂洗5 min重复5次后，利用FITC标记凝集素B4(10 μg/mL)室温25 ℃孵育4 h，自制漂洗液漂洗5 min重复5次后，DAPI染核15 min后洗去DAPI，甘油封片。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 和血明目片对CNV小鼠视网膜功能的影响

ERG是一项客观反映视网膜功能的指标。如图1和图2所示，与对照组相比，各干预组CNV小鼠视网膜功能均下降，表现为暗视3.0 ERG反应b波幅值降低(P<0.05)。此外，和血明目片对CNV小鼠视网膜功能具有保护作用，表现为和血明目片干预的实验组与生理盐水组相比，暗视3.0 ERG反应b波幅值相对较高(P<0.05)。并且和血明目片对CNV小鼠视网膜的保护作用存在明确的量效关系(图2)。

图1 实验动物暗视3.0 ERG反应典型波形Fig.1 Typical scotopic 3.0 ERG of experimental animals

图2 各组实验动物暗视3.0 ERG反应b波幅值比较注：*P<0.05,**P<0.01Fig.2 Comparison of the b-wave amplitudes of scotopic 3.0 ERG in each groupNote：*P<0.05,**P<0.01

2.2 和血明目片对CNV小鼠FFA检查结果的影响

眼底血管造影是临床检查眼底血管异常的金标准。如图3所示，与对照组小鼠相比，各组CNV小鼠眼底存在不同程度的强荧光渗漏，其中和血明目片干预组(图3A、B、C)的渗漏明显轻于生理盐水组(图3D)。根据Takehana等[14]的实验方法进行分级评估的结果显示(表1)，与生理盐水组相比，和血明目片干预后CNV眼底渗漏程度(P<0.05)。

图3 实验动物眼底FFA造影图像注：A.小剂量组；B.中剂量组；C.大剂量组；D.生理盐水组；E.对照组Fig.3 Images of fluorescein fundus angiography (FFA) of experimental animalsNote： A. Low dose group; B. Medium dose group;C. High dose group; D. Saline group;E. Control group

表1 各组实验动物眼底FFA荧光造影渗漏点分析情况Table 1 Analysis of leakage point of fluorescein fundus angiography (FFA) in each group

2.3 和血明目片对CNV小鼠脉络膜新生血管形成的影响

脉络膜铺片新生血管染色是CNV病理诊断的金标准。如图4所示，与对照组小鼠相比，各组CNV小鼠脉络膜铺片上激光光斑周围均出现不同程度的新生血管(图4中FITC标记的绿光荧光)，其中和血明目片干预组(图4A、B、C)与生理盐水组(图4D)相比，新生血管较少，表现为和血明目片干预组脉络膜铺片新生血管明显少于生理盐水组(图5，P<0.05)。

图4 实验动物脉络膜铺片新生血管染色图像注：A.小剂量组；B.中剂量组；C.大剂量组；D.生理盐水组；E.对照组Fig.4 Images of flat mounts of choroidal neovascularizationNote：A. Low dose group; B. Medium dose group; C. High dose group; D. Saline group; E. Control group

图5 各组实验动物CNV面积比较注：*P<0.05Fig.5 Comparison of CNV area in each groupNote: *P<0.05

3 讨论

CNV也称视网膜下新生血管，是一种起源于脉络膜血管的异常血管，其诱因主要与外伤、炎症、肿瘤等一系列因素相关。CNV形成后由于血管壁通透性高于正常血管，极易导致出血、渗出以及瘢痕的形成，最终导致视力的受损甚至致盲。本实验研究证实了和血明目片可以有效抑制激光诱导CNV小鼠模型脉络膜新生血管的形成。由于血管壁通透性高的新生血管形成减少，因此和血明目片干预组CNV小鼠眼底血管渗漏相对较轻。脉络膜是眼内血流最丰富的组织，主要负责视网膜外五层的营养支持。当发生CNV时，局部脉络膜循环将发生障碍，最终影响到脉络膜供血的外层视网膜功能，而表现出ERG反应幅值的下降。和血明目片因有效的抑制了CNV的产生，改善了脉络膜局部循环状态，最终保护了视网膜的功能。

和血明目片主要成分中的地黄、墨旱莲、牡丹皮具有凉血止血的功效，丹参、川芎、赤芍、郁金和茺蔚子等具有凉血破瘀的功效，菊花、牡丹皮、女贞子等具有养肝明目的功效，能够保护视网膜细胞功能以及促进炎性渗漏吸收[14-15]。这些成分都可能是其抑制CNV形成的物质，但是其具体机制尚不明确。CNV的形成受到多方面因素的影响，与其相关的信号分子包括VEGF、bFGF、HIF-1等[16-17]。除此之外，与其发病相关的因素还包括各种细胞的参与，以及多种生物因子的作用。和血明目片究竟是通过哪一种(或几种)机制发挥治疗作用还需进一步研究。

综上所述，本研究从动物实验角度出发证实了和血明目片对CNV 具有一定的治疗效果，为和血明目片在CNV相关疾病的临床应用提供了实验依据，同时也为下一步研究其具体机制奠定了基础。