氰氨化钙对植烟土壤微生物多样性的影响

刘晨祥，戴林建

湖南农业大学农学院，湖南 长沙 410128

优质烟叶的生产离不开优质土壤[1]。土壤微生物是土壤有机质和养分转化、循环的动力，并参与土壤中能量和养分循环等过程[2-4]。土壤微生物对土壤肥力有着至关重要的影响[5]。长期连作导致土壤肥力下降，病虫害增多，严重影响了烤烟生产的可持续发展[6]。土壤微生物中最常见的类群是细菌，细菌多样性对于土壤生态过程有着重要的影响[7，8]。因此，土壤细菌的群落结构可以很好的反映土壤的肥力状况[9]。施肥可以显著改善土壤肥力，利用有机肥料培肥土壤、参与农业生产可持续发展是中国农业的特色之一[10]。氰氨化钙是一种高效环保型生态药肥，具有提供养分和消除病菌的双重效果，施用后不会增加土壤盐分，对土壤环境无污染[11-14]。本试验以氰氨化钙、生物炭、饼肥等为试验材料，研究不同物料配施方式下烟田土壤微生物群落结构的变化特征，明确改善烟田土壤微环境的有效配置方式与施肥技术，为指导烟农合理施肥提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2019 年3 月下～8 月中旬在湖南省浏阳市永安镇丰裕村进行，北纬N28°16′8.47″，东经E113°20′21.90″。日照时数约为1600 h/a，平均气温17.5 ℃/a，无霜期270 d，降水量约均匀一致。供试土壤为烟稻轮作红壤土。基本农化性状：含有机质26.6 g/kg、碱解氮82.34 mg/kg、速效钾119.53 mg/kg、速效磷41.7 mg/kg、pH5.49。烤烟专用复合肥(N:P2O5:K2O=1551 mm，降雨期约为158 d，日照时数约为1595 h/a，属于亚热带季风气候。土壤肥力8:12:25)，氰氨化钙购于上海阿兹肯化工有限公司（总氮≥19.8%，钙≥35%），稻壳生物炭（有机质≥45%，氮磷钾≥5%，总碳≥20%），生物发酵菜籽饼肥由当地烟农提供（N+P2O5+K2O≥8%）。以烤烟HN2146 为供试品种。

1.2 试验设计

试验处理包括：T1 为150 kg/km2氰氨化钙施用量；T2 为施用150 kg/km2氰氨化钙+600 kg/km2生物炭；T3 为施用150 kg/km2氰氨化钙+600 kg/km2饼肥；T4 为施用150 kg/km2氰氨化钙+600 kg/km2生物炭+600 kg/km2饼肥；CK：当地烟叶栽培施肥方案。试验共设5 个处理，不设计重复，每个处理面积为180 m2，随机排列。各物料按照试验设计用量，施用时与基肥充分混合条施于垄间，其他烟田管理按当地烟叶生产技术方案进行。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 取样方法 于烤烟移栽100 d 后采集土壤样品，每个处理大区随机选定3 个点，每个点选取5株烟，并按距烟株7 cm 为半径的圆周处取根际土样，各点5 株烟所取根际土壤混合前，随机2 个点单独装入无菌密封袋中，立即放入冰盒中保存。带回实验室后放入在-80 ℃冰箱保存，一共15 个样用于土壤高通量测定微生物种群结构和多样性。

1.3.2 测定方法 土壤高通量测序在北京诺禾致源科技有限公司的Ion S5TMXL 测序平台进行。

1.4 数据分析

高通量测序分析在Novomagic 云平台（magic.novogene.com）进行。其他数据分析用SPSS 22.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理及不同时期植烟根际土壤细菌功能多样性分析

表1 是不同处理土壤样本的Alpha 多样性指数，不同处理样本的Coverage 指数都在98%以上，可以比较准确地反映不同处理样本的真实情况。各处理Ace 指数和Chao1 指数均低于CK，且以T2处理（氰氨化钙+生物炭混施)最低，表明T2 处理土壤样本的细菌种类最少，这可能是因为生物炭的施入提高了土壤的通透性，改变了土壤中厌氧菌的生存环境，不利于厌氧菌的生存，从而导致多样性指数降低。而同样施用了生物炭的处理T4，其Ace 指数和Chao1 指数均低于T1 与T3 而高于T2，这可能是因为随着饼肥的施入，为微生物提供了大量营养物质，促进了微生物的活动，进而导致多样性指数升高。各个样本的平均Shannon 指数大于7，说明植烟根际土壤细菌群落多样性水平较高。

表1 不同处理土壤细菌Alpha 多样性Table 1 Different treatments for soil bacterial Alpha diversity

2.2 不同处理植烟根际土壤细菌群落结构分析

在门水平上，5 个处理的土壤样本主要分属49 个门，126 目，229 科。对各处理相对丰度前十的菌门进行统计，约占总菌门数量的78.37%至79.94%。各处理土壤中的第一大类群细菌为变形菌门(Proteobacteria)，在各土壤样品中均占细菌数量的30%以上。第二大类群为酸杆菌门(Acidobacteria)，在各土壤样品中占细菌数量的比例在10%以上。第三大类群为绿弯菌门(Chloroflexi)，也占细菌数量的10%左右。这3 类菌占到了土壤细菌的一半以上。

在属水平上对各土壤样本进行分析发现，5 个处理土壤样本共得到461 个菌属，其中以Thiobacillus、Haliangium、Unidentified-Acidobacteria、Unidentified-Deltaproteobacteria四类菌属丰度值较大。但Thiobacillus在T1 处理中的丰度明显高于其他四个处理，说明单独施用氰氨化钙可以提高Thiobacillus的相对丰度。T3 处理相对于CK，明显提高了Haliangium的相对丰度。

2.3 不同处理植烟根际土壤细菌群落组成主成分分析

对不同处理植烟根际土壤样本进行PCA (Principal Component Analysis)分析，结果如图1 所示。选取的最大程度反映处理间差异的2 个处理，其方差累计贡献率分别为11.24%和9.75%，其中，T2、T3 与T4 处理中，T2 处理对PC1 的贡献表现最低，T3 处理与T4 处理差异不大，这说明氰氨化钙与生物炭配施对土壤样本细菌群落有明显影响。T1 处理土壤样本距离CK处理土壤样本最远，说明氰氨化钙单独施用对植烟土壤细菌群落影响最大。总体而言，施用氰氨化钙影响了土壤细菌群落结构，且相比于其他物料配施，氰氨化钙单独施用的效果最明显。

图1 不同处理植烟根际土壤样本PCA 分析Fig 1 PCA analysis of rhizosphere soil samples with different treatments

3 讨论

本试验通过对土壤微生物进行高通量测序分析发现，与对照组相比，施用氰氨化钙的土壤样本细菌Ace 指数、Chao 指数和Shannon 指数总体上均有所下降，但差异不明显，其中，T3＞T4＞T2＞T1。这可能是因为施用饼肥能提高土壤中细菌的丰富度和多样性，生物炭会改变土壤的通透性，影响土壤中厌氧环境条件下的细菌多样性，氰氨化钙施入土壤中对于敏感性较强的病原微生物可以起到很好的抑制作用甚至消除，因此导致各处理土壤样本中细菌多样性均低于CK 处理，其中以氰氨化钙单独施用的处理T1 最低。

土壤中功能微生物的数量可直观表现土壤养分循环能力以及抗病能力，各处理土壤样本的主要细菌类群为变形菌门、酸杆菌门(Acidobacteria)和绿弯菌门等。纯氰氨化钙处理的土壤样本变形菌门与酸杆菌门的相对丰度均有所提升。其中，变形菌门具有固氮功能，变形菌门的增多能够更有效的固定氮源。酸杆菌门是土壤中一类重要的细菌类群，在土壤的生态过程中起着重要的作用。本研究发现，T1 处理土壤样本中硫杆菌属的相对丰度显著高于其他处理，这可能是由于单独施用氰氨化钙，为土壤细菌提供了充足的碳源和氮源，促进了细菌的生长繁育。本试验中，单施氰氨化钙处理在主成分中与其他处理明显区别开来，可能是因为，当氰氨化钙与生物炭或饼肥混施后，其对部分微生物的繁殖的抑制效果大于对部分微生物的繁殖的促进效果，因而对丰富度和均一度造成一定影响。

4 结论

综合土壤细菌多样性、结构组成、相对丰度以及主成分分析来看，单施氰氨化钙的效果最好。氰氨化钙的施用为土壤提供了充足的碳源与氮源，选择性消除了土壤中的部分病原微生物，提高了土壤中功能微生物的相对丰度，调节了植烟土壤细菌群落结构，有利于提高土壤的抗病能力，从而达到控制土传病害的目的。