沉默囊泡分选蛋白(VPS)对辣椒疫霉效应因子RxLR504 功能的影响

朱彤彤，马艳飞，江韦霖，杨 磊，李念袁，董一帆，辛 琪，张修国*，孙文秀*

1.长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434000

2.山东农业大学植物保护学院，山东 泰安 271018

大多数的疫霉属卵菌是重要的植物病原菌，可以侵染辣椒、番茄、马铃薯等在内的多种经济型作物，严重危害全球的农业生产，并影响整个生态系统。如1846 年致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的爱尔兰饥荒，橡树疫霉（P.ramorum）造成的美国及加拿大的橡树猝死，大豆疫霉（P.sojae）引起的大豆根茎腐病，给农业造成了巨大经济损失[1]。在植物与病原菌的长期协同进化过程中，病原菌通过分泌效应蛋白进入寄主细胞的不同部位，干扰寄主细胞正常的代谢过程，破坏寄主的防卫反应，营造出一个适于自身繁殖的小生境[2，3]。效应蛋白主要分为质外体效应蛋白及胞质效应分子，胞质效应分子包括RxLR 效应分子及CRN 效应分子，在病原菌定殖过程中起着重要作用[4，5]。

在真核生物中，蛋白质的跨膜运输以及跨区室运输是通过囊泡的定向运输完成，囊泡运输是通过细胞质膜上的物质与运输相关分子共同作用，形成囊泡定向与胞内运输小泡融合运输至靶膜和靶细胞器上[6]。参与此过程的效应分子中，Rab GTPase 起着重要作用，通过囊泡运输调节运输特异性、细胞器间的物质交换和信息传递[7]。VPS 蛋白即为Rab 蛋白家族一员。近年来，越来越多的研究报道Rab 可能参与了生长素与植物发育、信号转导、自噬与细胞程序性死亡、细胞骨架形成等多个生物学过程。Friml 对PIN 类生长素输出蛋白定位和运输的研究有助于对生长素分布与植物发育关系进行描述[8]。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）被报道可以通过与Rab 蛋白的相互作用调节膜运输[9，10]。抗凋亡蛋白Bcl-2 联系细胞凋亡和自我吞噬之间的调节，通过与Beclin 1 连接抑制依赖于Beclin 1 的自噬作用，同时Beclin 1 隔断与VPS34 的联系[11]。然而目前还没有对Rab 参与抗病具体机制和互作蛋白的报道。

病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）属于转录后沉默（Post-transcriptional Gene Silencing，PTGS）[12]。其作用原理是带有目的基因的载体侵染植物后，在植物体内进行复制及表达时形成双链RNA（Double stranded RNA，ds RNA），在反转录时dsRNA 被特异性的内切酶切割成小分子RNA（Small interfering RNA，siR NA），而后siRNA 在植物体内与蛋白质结合为RNA 沉默复合体（RNA-induced Silencing Complex，RISC），RISC 与细胞内RNA 互作从而产生沉默现象[13]。烟草脆裂病毒是广泛应用于植物中的一种双向瞬时表达载体，分别使用两种不同的根瘤农杆菌（TRV1、TRV2）共同作用于植物体实现基因沉默[14]。与普通常规的转基因技术相比，VIGS 技术可明显缩短试验时间，一般在2～3 周就会出现明显效果。VIGS 技术既可适用于单子叶植物也可适用于双子叶植物，目前在番茄、马铃薯、豆类植物中都有应用[15-17]。VIGS 技术具有简便、高效、高通量的优势，近年来在基因功能研究中应用较为广泛[18]。

前期证明通过酵母双杂，免疫共沉淀及双分子荧光实验证明证明辣椒疫霉效应分子RxLR504 与囊泡分选蛋白(VPS)相互作用。本实验以VPS 为沉默对象，实验室本氏烟为供试材料，进而在囊泡分选蛋白VPS 表达缺陷植株上验证RxLR504 抑制INF1 引起的坏死能力是否丧失。研究结果为探索RxLR504 在辣椒疫霉致病机理中的功能提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

供试烟草为本实验室保存的本氏烟Nicotiana benthamiana，种植于25 ℃恒温温室，湿度70%，光照16 h、黑暗8 h 交换更替。

Trans5α、GV3101 购自北京全式金生物技术有限公司，限制性内切酶BamHI、SmaI 购自赛默飞生物公司。烟草瞬时沉默载体pTRV1、pTRV2 及沉默对照TRV::PDS 载体由清华大学刘玉乐老师馈赠。辣椒疫霉标准菌株LT1534 以及含RxLR504 效应分子、Avr3a、INF1 及GFP 农杆菌菌株均保存于山东农业大学植物保护学院真菌资源与利用研究室。

1.2 NbVPS 基因克隆及沉默载体构建

通过本氏烟基因组网站https://solgenomics.net/tools/blast/比对NbVPS 基因序列，以本氏烟cDNA为模板，克隆基因。通过https://vigs.solgenomics.net/工具设计沉默片段，利用BamHI、SmaI 限制性内切酶将沉默片段构建至pTRV2 病毒载体，转化大肠杆菌DH5α，测序验证。测序正确后，提取质粒转化至植物表达菌株GV3101，命名为TRV::NbVPS。

1.3 本氏烟的沉默实验

挑取含TRV1、TRV::PDS、TRV::GFP 及TRV::NbVPS 农杆菌单菌落，接种至添加利福平及卡那霉素的LB 液体培养基中，放置于28 ℃恒温摇床，220 r/min，震荡过夜培养。4000 rpm 离心5 min收集菌体，充分倒尽上清后，加入10 mM MgCl2洗涤菌体3 次；加入适量的10 mM MgCl2(含10 mM MES，200µM As)缓冲液悬浮菌体，使悬浮液OD600值达到1.0。静置2 h 以上后，分别将TRV::NbVPS、TRV::PDS、TRV::GFP 菌悬液与TRV1 菌悬液等体积混合，取3-4 叶期本氏烟植株，将菌悬液接种于下部分最大两片烟叶，并在相同条件下培养2～3 周，进行下步试验。

1.4 沉默效率验证

待接种TRV::PDS 对照植株顶端叶片出现白化现象时，收取接种TRV::NbVPS 实验组及TRV::GFP对照组植株顶端叶片，采用OMEGA 植物RNA 提取试剂盒进行本氏烟RNA 提取，实验步骤参照试剂盒说明书。以RNA 为模板，参照诺唯赞反转录试剂盒说明书，在冰上进行反转录实验，构建cDNA库。运用Primier Quest Tool(http://sg.idtdna.com/Primer Quest/Home/Index)软设计NbVPS 特异性引物。以本氏烟持家基因actin 作为内源参照，接种TRV::GFP 植株中VPS 基因表达量作为对照，验证TRV::NbVPS 植株中靶标基因表达水平。采用诺唯赞荧光定量试剂盒进行qRT-PCR 检测，检测步骤参照试剂盒说明书进行。相比于对照，实验组靶标基因表达量为正常表达水平30%以下即为沉默成功，证明该植株可作为供试植株作为下步实验。

1.5 沉默后效应因子功能检测

按上述方法制备含RxLR504、GFP、INF1 农杆菌菌悬液，调整OD600值为0.5 左右，静置2 h以上。以注射GFP 及Buffer 为对照，在本氏烟草叶片接种RxLR504，24 h 后在相同部位接种INF1菌悬液。一周后，观察接种叶片症状，拍照记录结果。

2 结果与分析

2.1 沉默片段设计

在VIGS Tools 网站中置入目的靶标基因序列，设计特异性沉默片段，如图1 所示，沉默片段长度为300 bp，位于609-908 位阅读框，靶标区域检测分数为81，质量较好。

图1 VIGS Tool 沉默片段设计Fig.1 Design of silence fragment by VIGS Tool

随后，成功以特异性引物从本氏烟基因组文库中克隆靶标片段，并构建至病毒沉默载体pTRV2，获得重组载体TRV::NbVPS。将重组载体转化至GV3101 农杆菌表达菌株，用于下步实验。

2.2 样品RNA 提取及检测

将制备好混有TRV1 辅助载体的TRV::NbVPS、TRV::GFP、TRV::PDS 农杆菌菌悬液分别注射烟草，待TRV::PDS 处理的叶片呈现明显白化现象时，其他处理的烟草叶部生长状况与野生型烟草无明显区别。提取对照组及实验组RNA，分光光度计检测显示，样品OD260/OD280值均在1.8～2.0 之间，说明所提取的总RNA 纯度较高，OD260/OD230值均在2.0 左右，说明RNA 样品盐离子污染低。经琼脂糖凝胶电泳检测，样品的28S 及18S 条带明亮、清晰、条带锐利，且28S 条带亮度在18S 条带的两倍以上，RNA 质量好，结果可靠（图2）。

图2 本氏烟总RNA 凝胶电泳检测Fig.2 Gel detection of the N.benthamiana total RNA

2.3 沉默效率验证

利用南京诺唯赞生物公司反转录试剂盒，以RNA 为模板构建cDNA 文库。qRT-PCR 检测试剂盒购自南京诺唯赞生物公司，NbVPS 在本氏烟中表达量是相对于内源持家基因NbActin 而定。

图3 靶标基因沉默效率检测Fig.3 Silence detection of the target gene

结果显示（图3）：TRV::NbVPS 处理植株叶片中，NbVPS 基因表达量明显下调，与TRV::GFP相比显著下降86.2%。表明农杆菌接种处理2～3 周后，VIGS 沉默体系引起靶标基因NbVPS 的特异性下调表达，植株可用于后续研究。

2.4 沉默植株上RxLR504 功能检测

以接种Avr3a、GFP 及Buffer 作为对照，在沉默NbVPS 本氏烟上瞬时表达RxLR504，24 h 后在相同注射部位接种死亡激发子INF1，同时以TRV::GFP 沉默植株作为对照。接种一周后，观察实验结果并拍照记录。

图4 沉默植株上RxLR504 功能检测Fig.4 Function detection of RxLR504 in silenced lines

结果如图4 所示，在TRV::GFP 对照沉默植株及TRV::NbVPS 靶标基因沉默植株中，阳性对照Avr3a 仍强烈抑制INF1 引发的细胞死亡。阴性对照GFP 及Buffer 皆不能抑制INF1 引发的细胞死亡，叶片坏死。注射效应因子RxLR504 部位与注射阳性对照Avr3a 部位症状相同，说明RxLR504 在本氏烟上抑制INF1 引发细胞死亡能力不变。

3 讨论

Rab 蛋白是小GTPase 蛋白家族中数量最为庞大的成员，几乎参与所有细胞内的跨膜运输，Rab蛋白功能的正常行使在生物体内起着重要作用。液泡分选蛋白（Vacuolar sorting protein，VPS）VPS是Rab 蛋白家族的重要构成成分。目前，有关VPS 功能的研究主要集中细胞凋亡、植物自噬和生长素运输等生物学过程[19]，尚未见植物抗病过程中相关报道。因此对植物中VPS 的功能分析及与辣椒疫霉效应分子RxLR504 的相互作用研究，为进一步探索植物与病原物的互作机理及更好地设计生物农药提供理论依据。

植物在与病菌的长期斗争中，形成了一套对付病菌有效的免疫功能。对卵菌无毒基因的克隆和研究对于了解病原菌致病性和寄主植物的专化抗性具有重要意义。INF1 是致病疫霉（P.infestans）的elicitin，能够诱导本氏烟细胞产生HR 反应，防卫反应过程中产生生理生化的改变。因此INF1 可以用来诱导产生PAMP 触发的PCD（PT-PCD），RxLR504 作为卵菌的效应分子，不会跨物种与INF1互作而影响其功能，其作用位点应该是植物的防卫反应信号通路或下游基因的表达。因此，鉴定效应分子抑制PTI 通路中的作用靶标及调控因子对理解病原物致病机制和植物抗病机理具有重要意义。

本研究利用VIGS 沉默烟草液泡分选蛋白VPS，经沉默处理后，VPS 基因表达量在TRV::NbVPS烟草中与TRV::GFP 对照烟草相比显著下降，说明VIGS 沉默体系的可靠性。进一步开展在烟草叶片上瞬时过表达实验发现，辣椒疫霉效应分子RxLR504 仍然能够在VPS 表达缺陷植株上抑制INF1 引发的坏死，证实VPS 不参与植物免疫的PTI 通路。效应分子功能的复杂性说明其可能作用与植物防卫通路的各个组成部分，它们通过共同协作使病原菌发挥出最大毒力，充分抑制寄主的防卫反应，控制病原菌对寄主的侵染过程。RxLR504 抑制INF1 引发的细胞死亡的PTI 通路涉及的靶标蛋白及调控途径还有待今后进一步研究。