表达KsdD 重组大肠杆菌的构建及转化工艺优化

汤 睿，申雁冰，耿宇菡，赵云秋，王 敏

工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457

甾体药物是仅次于抗生素的第二大类药物，在临床上具有重要应用。目前，对甾体骨架结构的修饰和改造是甾体药物主要的合成途径，包括羟化、脱氢、侧链降解等[1-3]。其中，甾体化合物的C1，2 位脱氢反应在甾药合成中具有重要意义，在甾体药物的C1，2 位引入双键有助于其药用效能的提高[4-6]。而化学法脱氢过程中总伴有硒的残留，且很难去除；因此采用微生物催化的方法进行甾体化合物的脱氢反应具有重要意义。

催化甾体化合物的C1，2 位脱氢反应的关键酶是3-甾酮-Δ1-脱氢酶（KsdD[EC 1.3.99.4]），为了提高甾体C1，2 位脱氢效率，一方面可以通过遗传学操作手段，提高分支杆菌或简单节杆菌等菌体自身KsdD蛋白的基因表达水平[7]；另一方面可以将KsdD蛋白于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母等工程菌株中外源表达，构建具有C1，2 位脱氢能力的工程菌株。已有研究将烟曲霉来源的ksdDF基因于Pichia pastorisGS115 中进行外源表达[8]，使1.5 g/L 底物雄甾-4-烯-3，17-二酮（AD）几乎能够全部被转化，但P.pastoris的培养周期较长，此外由于P.pastoris中存在17β-羰基还原酶的作用，其产物中还有宝丹酮的产生。虽然将Mycobacterium neoaurumJC-12 来源的ksdD基因于Bacillus subtilis中进行外源表达[9]，可使AD 的转化率达65.7%，为野生菌株的18 倍，但其转化效率依然无法达到工业生产的需求。因此，为了解决现有研究中存在的工程菌生长代谢周期长、催化脱氢的KsdD酶活性低等问题，本研究通过蛋白序列及关键氨基酸位点的比对分析，结合酶活性及催化性能比较，筛选出具有较高C1，2 位脱氢催化活性的KsdD蛋白，并构建了含有该KsdD蛋白的大肠杆菌重组表达菌株；经对该重组大肠杆菌转化底物AD 条件的优化，实现了产物雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮（ADD）的高效生产，为利用工程菌株高效生产C1，2 位脱氢甾体化合物的研究奠定了理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 菌株和质粒Escherichia coliBL21 (DE3)，Rhodococcus rhodochrousDSM43269，A.simplexCPCC 140451，M.neoaurumTCCC 11028 MNR(MNR)：本实验室保藏；pET28a(+)：本实验室保藏。

1.1.2 培养基LB 培养基（g/L）：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，pH 7.5。固体培养基中添加2%琼脂粉。固体和液体培养基在需要时加入卡那霉素50 μg/mL。

简单节杆菌培养基（g/L）：葡萄糖10，玉米浆10，蛋白胨5，磷酸二氢钾2.5，pH7.2。

分枝杆菌培养基（g/L）：磷酸氢二钾0.5，硫酸镁0.5，柠檬酸铁铵0.05，柠檬酸2，硝酸铵2，丙三醇20，葡萄糖5，碳酸钙10。

红球菌培养基（g/L）：蛋白胨4，酵母膏12，葡萄糖12，pH 7.0。

1.1.3 化学试剂 葡萄糖、乙酸乙酯：天津市福晨化学试剂厂；酵母提取物、胰蛋白胨：英国OXOID公司；甲醇（色谱纯）：天津市康科德科技有限公司；AD(D)（≥98%）：天津市津津药业有限公司；羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）：西安德立生物化工有限公司；DNA 聚合酶、DNA 连接酶、限制性内切酶：大连宝生物工程有限公司；IPTG、卡那霉素、质粒提取试剂盒、DNA 纯化回收试剂盒、切胶回收试剂盒：北京Solarbio 科技有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒：北京天根生化科技有限公司；其他试剂均为分析纯：国药化学试剂有限公司。

1.2 仪器

ZHWY-211F 恒温摇床：上海智诚分析仪器制造有限公司；PCR 基因扩增仪：德国Eppendorf 公司；UVmini-1240 紫外可见分光光度计：日本岛津公司；DYY-6C 电泳仪：北京市六一仪器厂；Agilent1260 型高效液相色谱仪（HPLC）：美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重组菌株的构建方法 首先根据已报道的ksddR2（GenBank：KU257604）、ksddM（GenBank：GQ228843.1）及KsdDA（GenBank：BAA07186.1）的基因序列设计引物（表1），采用细菌基因组DNA 提取试剂盒分别提取R.rhodochrousDSM43269、M.neoaurumTCCC 11028 MNR 及A.simplexCPCC 140451 基因组DNA，并以获得的基因组序列为模板，通过表1 中的引物对目的基因ksdd序列进行扩增。将获得的基因片段与大肠杆菌表达载体pET28a 经限制性内切酶NcoI 和Hind III 双酶切后，按插入片段:载体片段=3:1 的比例进行连接，分别获得重组表达质粒pET28a-KsdDR2、pET28a-KsdDM及pET28a-KsdDA。然后将成功构建的重组质粒经化学转化法分别转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，37 ℃培养过夜，挑取阳性克隆子，经金唯智公司测序验证后，获得分别含有目的基因KsdDR2、KsdDM及KsdDA的重组大肠杆菌表达菌株。

表1 本实验所使用的引物Table 1 Primers used in this experiment

1.3.2 培养及转化方法 将重组大肠杆菌以1%的接种量接种于5 mL 含卡那霉素的LB 液体培养基中，37 ℃，200 r/min，过夜培养。再以1%的接种量接种于含50 mL 新鲜LB 培养基的250 mL 摇瓶中，培养至OD600 约为0.6 左右，加入IPTG 至终浓度0.2 mM，16 ℃，200 r/min，诱导培养16～18 h，取样进行SDS-PAGE 分析。

向诱导后的发酵液中投加2%甲醇（或2%乙醇、2%吐温80、与AD 摩尔比为1:1 的HP-β-CD）助溶的1.2 g/L 底物AD，30 ℃（或20 ℃、25 ℃、35 ℃），200 r/min 转化3 d，每24 h 取样1 mL，以等体积乙酸乙酯萃取后，进行TLC 及HPLC 分析。

1.3.3KsdD酶活测定方法 本研究参考Van der Geize 等测定KsdD酶活的方法（DCPIP 法）[10]，对过表达菌株中KsdD酶活进行测定。将50 mM 的Tris-HCl(pH 7.0)、40 μM 的2，6-二氯酚靛酚(DCPIP)、1.5 mM 的吩嗪硫酸甲酯(PMS)、500 μM AD（溶于2%的甲醇）及适量的粗酶液在同一体系中混合均匀，采用分光光度计于600 nm，30 ℃下测定底物DCPIP 每分钟的还原量nmol(ɛ600nm=18.7×103cm-1M-1)。定义每分钟还原1 nmol DCPIP 所需的酶量为1 个酶活单位，用mU 来表示。根据酶活定义得到酶活计算公式：。其中Vt为反应液总体积；Vs为待测样品体积；e为摩尔吸光系数；L为比色杯光径(cm)。其比酶活单位为mU/mg。

1.3.4 甾体化合物的测定方法 通过TLC 法对甾体转化情况进行分析，取经乙酸乙酯萃取后的有机相，点板后在（乙酸乙酯:石油醚=3:2）的展开剂中展开，254 nm 下观察硅胶板。

采用HPLC 法对甾体转化率进行分析，取100 μL 经乙酸乙酯萃取后的有机相挥干后，以1 mL流动相复溶，用0.22 μm 滤膜对复溶样品进行过滤，然后通过HPLC 检测，色谱柱为Phenomenex C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），流动相为甲醇:水（80:20，v/v），流动相流速为1 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为254 nm。

2 结果与分析

2.1 KsdD 蛋白序列的筛选

KsdD是催化底物AD 合成ADD 的关键酶，目前只有来自于R.erythropolisSQ1 的KsdDSQ蛋白晶体结构得到解析，其蛋白活性中心有四个关键氨基酸残基Tyr119，Tyr318，Tyr487 和Gly491 对酶的催化活性至关重要[11]；且实验室前期研究发现，分枝杆菌中的KsdDM蛋白分别与其对应的Tyr125、Tyr365、Tyr541 及Gly545 位点同样对酶的催化活性必不可少，且位点Tyr122 及Ser138 对酶的催化活性也同样重要[12，13]。于是，我们通过氨基酸序列比对，自GenBank 数据库中筛选出11种不同来源的KsdD蛋白，并对这些蛋白与已报道的KsdDSQ进行了序列比对，对其作用的关键氨基酸位点进行了分析。

图1 不同来源KsdD 氨基酸序列比对Fig.1 Comparison of KsdD amino acids sequences from different sources

由图1 中可以看出，除KsdD1外，其余11 种KsdD中均存在Tyr125、Tyr365、Tyr541 及Gly545四个关键氨基酸位点；而在这些KsdD中，仅有KsdDM，KsdDR2，KsdDR3三种KsdD同时存在Tyr122及Ser138 关键氨基酸位点，其余KsdD中相应位点均由不同的氨基酸残基所取代。而由实验室前期研究发现，KsdDR2的C1，2 位脱氢能力要强于KsdDR3，且由RT-qPCR 验证发现，KsdDR3不能被AD所诱导[14]；此外，由于简单节杆菌是工业上已广泛使用的脱氢菌株[15]，因此本研究从KsdDR2、KsdDM及KsdDA三种蛋白中进一步筛选具有较高脱氢活性的KsdD蛋白。

2.2 含KsdD 基因重组大肠杆菌的构建

为了进一步筛选出具有较高脱氢活性的KsdD蛋白，本研究采用1.3.1 中的方法分别构建了含有目的基因KsdDR2、KsdDM及KsdDA的重组大肠杆菌表达菌株。将菌株通过1.3.2 中所述的方法进行IPTG 诱导表达，结果如图2 所示。可以看出，与对照组相比，三株重组大肠杆菌均在60 kDa 左右位置有明显差异条带，这表明三株重组大肠杆菌中的目的基因均获得成功表达。

图2 重组大肠杆菌的SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE analyses of recombinant E.coli BL21

2.3 重组大肠杆菌KsdD 酶活比较及转化性能分析

为了进一步比较含有目的基因KsdD的重组大肠杆菌的C1，2位脱氢活性差异，本研究采用DCPIP法对重组大肠杆菌中KsdD的酶活进行了测定。结果如表2 所示，三种重组大肠杆菌中均检测到KsdD酶活，且过表达KsdDR2的重组大肠杆菌的酶活明显高于KsdDM，而KsdDA的重组大肠杆菌酶活最低，仅为KsdDR2的64.2%，这表明过表达KsdDR2的重组大肠杆菌具有更高的C1，2 位脱氢能力。由此可见，Ser138 及Tyr122 氨基酸残基对KsdD酶的催化活性至关重要，这与实验室前期研究结果相符[12，13]。

表2 过表达KsdD的重组大肠杆菌酶活分析Table 2 The specific activity of different recombinant E.coli BL21 strains

图3 重组大肠杆菌对AD 转化水平的分析Fig.3 Analysis of AD transformation level by recombinant E.coli BL21

对三种重组大肠杆菌对底物AD 的转化能力进行了分析，结果如图3。由TLC 分析结果可以看出，过表达KsdDR2的重组大肠杆菌对底物AD 的转化能力，明显高于过表达KsdDM或KsdDA的重组大肠杆菌。进一步经HPLC 分析发现，底物AD 经过表达KsdDR2的重组大肠杆菌转化后，其转化率达到85%，分别比过表达KsdDM或KsdDA重组大肠杆菌的转化率高出16%及59%（图4）；且初始转化速率较过表达KsdDM或KsdDA重组大肠杆菌分别提高了0.56 倍和4 倍。而李玉[16]和张成刚[17]等的研究也指出，KsdDM或KsdDA在大肠杆菌中表达多会形成包涵体，这也是严重影响其脱氢酶活性的关键因素之一。因此我们认为，脱氢酶KsdDR2在重组大肠杆菌中具有更高的催化活性，更有利于产物ADD 的积累。

2.4 含KsdDR2蛋白的重组大肠杆菌转化条件优化

2.4.1 重组大肠杆菌转化温度对ADD 产率的影响 转化体系的温度会影响酶的活性，进而影响转化的进行。为了探究本研究中过表达KsdDR2的重组大肠杆菌在转化底物AD 时的最适转化条件，我们首先探究了不同转化温度对AD 转化的影响，结果如图5 所示。ADD 的产率随转化体系温度的升高而增加，当转化体系中温度达到30 ℃时，ADD 的产率达到85%；而当体系中温度进一步增加时，ADD的产率反而有所下降。任尧等[18]在利用重组大肠杆菌进行黄体酮的催化研究中，也发现类似的现象因此在本研究中，转化温度为30℃时最有利于转化的进行。

图4 重组大肠杆菌对AD 转化过程的分析Fig.4 Analyses of AD transformation process by recombinant E.coli BL21

图5 转化温度对ADD 产率的影响Fig.5 Effects of temperatures on the productivity of ADD

2.4.2 转化体系中助溶剂种类对ADD 产率的影响 甾体化合物在水中的溶解度很低，这严重阻碍了菌体对底物的有效利用。而甲醇、乙醇等亲水性有机溶剂，及吐温80 等表面活性剂，对甾体化合物具有较好的溶解性，常被用作甾体转化中的助溶剂[19-21]；环糊精作为一种水溶性较高的促溶剂，以其特殊的结构特点，能够在水溶液中选择性地包结有机分子，形成不同稳定程度的包结物，由于其对菌体的毒副作用较小，已被广泛地应用于甾体药物的转化中[22]。因此，本研究通过分析甲醇、乙醇、吐温80 及HP-β-CD 等助溶剂对底物作用，以进一步提高菌体对底物的催化效率。由图6 可以看出，在不同助溶剂的作用下，重组菌株对AD 的转化能力不同；当在HP-β-CD 的作用下时，AD 的转化率最高可达92%，相较于甲醇、乙醇和吐温80 分别高出7%、21%和36%。这可能是由于有机试剂对菌体有不同程度的毒害作用，不利于菌体的生长及转化的进行；而环糊精对甾体底物具有较强的增溶作用，且作用较温和，对菌体毒害作用小，因此更有利于转化的进行[23]。

图6 不同助溶剂对ADD 产率的影响Fig.6 Effects of different cosolvents on the productivity of ADD

图7 HP-β-CD 与AD 的摩尔比对ADD 产率的影响Fig.7 Effects of HP-β-CD and AD molar ratios on the productivity of ADD

2.4.3 HP-β-CD 添加量对ADD 产率的影响 此外，HP-β-CD 的添加量同样会影响底物转化率，为了进一步提高产物ADD 生成率，本研究还分析了不同底物AD 与HP-β-CD 的添加比例对ADD 产率的影响。结果如图7 所示，随着HP-β-CD 含量的增加，产物ADD 的生成率有所提升。当底物AD 与HP-β-CD的摩尔比达到1:1.5 时，产物ADD 的生成率达到99%；当HP-β-CD 含量继续增加时，产物ADD 的生成率基本未变。因此，综合考虑转化成本和产物的获得，我们认为底物AD 与HP-β-CD 的摩尔比为1:1.5 时更适合转化的进行。

3 结论

C1，2 位脱氢反应是甾体化合物生物转化中的一步重要反应，虽然催化该反应的关键酶KsdD蛋白广泛存在于微生物细胞内，但因其序列的多样性，多数KsdD蛋白在大肠杆菌中表达并不具有较高的催化活性。本研究结合相关报道，经蛋白序列的比对及关键氨基酸位点的分析，并结合酶活性分析及底物催化性能比较，筛选出于大肠杆菌中表达具有较高C1，2 位脱氢能力的KsdDR2蛋白。此外，由于甾体化合物较低的水溶性限制了转化率的提高，因此本研究探究了不同助溶剂对甾体化合物的作用效果，最终确定HP-β-CD 对底物的增溶作用较好，更有利于转化的进行。通过对过表达KsdDR2蛋白重组大肠杆菌的底物转化条件进一步研究，确定底物AD 在30 ℃转化条件下，经与摩尔比1:1.5 的HP-β-CD 的共同作用，可使AD 的转化率达到99%，该研究为利用工程菌株高效生产C1，2位脱氢甾体化合物的研究奠定了理论基础。