吐温80在油脂类调味品中微生物检测的研究分析

汪红梅 许晓琳 何芙蓉

摘 要：通过对牛肉酱、红油2种即食油脂类调味品进行微生物检测，将不同比例的吐温80添加到样品前处理的稀释液中，采用浓度为107 CFU·mL-1的标准菌悬液，用常规细菌培养法检测结果。结果表明：选用比例为5%的吐温80对牛肉酱、红油的微生物指标进行检测，检测结果均在107 CFU·mL-1，与空白对照的检测结果在同一数量级上。与常规的稀释液相比，吐温80可使样品均匀分散在稀释液中，且不影响微生物的检测结果，可适用于高油脂类样品的日常微生物检测。

关键词：吐温80;油脂类调味品;乳化反应;致病菌

Abstract：Through the microbial detection of two kinds of instant oil condiments， beef sauce and red oil， the different proportion of Tween 80 was added to the diluent of sample pretreatment， the standard bacterial suspension with concentration of 107 CFU·mL-1 was used， and the results were detected by conventional bacterial culture method. The results showed that the ratio of Tween 80 was 5% to detect the microbial index of beef sauce and red oil， and the results were all in the range of 107 CFU·mL-1 which was the same order of magnitude as the blank control. Compared with conventional diluent， Tween-80 can disperse the sample in diluent without affecting the result of microbial detection， and can be used for routine microbial detection of high-fat samples.

Key words：Tween 80; Oils and fats condiment; Emulsification reaction; Pathogenic bacteria

中图分类号：TS207.4

吐温80（Tween80，聚氯乙烯20山梨醇酐单油酸酯）是一种非离子型表面活性剂[1]，具有增容、乳化、分散和稳定等作用，在医药、食品、化妆品等领域中应用广泛[2-3]。通过在样品制备中添加一定比例的吐温80对油脂类食品进行微生物检测，可有效改善样品分布的均匀性和实验结果的准确性，减少因样品的高油脂成分而产生的实验误差，优化实验过程，提高实验质量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

（1）材料。牛肉酱、红油，油脂含量均超过20%，产自上海千彩食品有限公司;氯化钠，分析纯，购自广东光华科技股份有限公司;氢氧化钠，分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司;吐温80，化学纯，购自上海沪试;PCA琼脂、NB琼脂、EMB琼脂、TCBS琼脂、B-P琼脂、沙门显色培养基、弧菌显色培养基，均购自北京陆桥技术股份有限公司。

（2）仪器。恒温生化培养箱（型号：SHP-160，上海三发科学仪器有限公司）;立式压力蒸汽灭菌锅（型号：YXQ-LS-75SII，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）;数显电热恒温水浴锅（型号：HH·S21-6S，上海跃进医疗器械有限公司）;生物安全柜（型号：BSC-1600IIA2，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）;微型旋涡混合仪（型号：XW-80A，上海沪西分析仪器厂有限公司）;单道可调节移液枪（型号：100～1 000 μL，BRAND）。

1.2 商品化生化試剂盒和血清

沙门氏菌生化试剂盒、大肠埃希氏菌生化试剂盒、副溶血性弧菌生化试剂盒，购自北京陆桥技术股份有限公司;沙门氏菌血清（O价，H价血清）、大肠埃希氏菌血清，购自宁波天润生物药业有限公司;兔血浆，购自青岛海博生物技术有限公司。

1.3 试验用菌种

大肠埃希氏菌（ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、鼠伤寒沙门氏菌（ATCC14028）和副溶血性弧菌（CICC 21617）均为第二代标准储备菌株，购自浙江格陵设备科技有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 稀释液制备

在0.85%的生理盐水中加入一定比例的吐温80，分别制备成1.0%、2.5%、5%、8%和10%共5种不同比例的吐温80水溶液，装入1 000 mL锥形瓶中，调节pH至7.2～7.4。将5种不同比例的吐温80水溶液分别移至18 mm口径的试管中，每根试管9 mL，备用。准备一根9 mL生理盐水空白对照管。将上述所有稀释液进行灭菌，121 ℃，15 min，备用。

1.4.2 样品乳化试验

用移液枪将准备好的样品分别加入上述各比例9 mL试管中，每根试管加入1 mL样品，用涡旋混合仪混合30 s后，放置观察样品乳化分散效果[4]，并记录数据。

1.4.3 试验菌液制备

将4支试验菌株提前增菌，复壮。各取1 mL肉汤培养物加入到9 mL无菌生理盐水中，按10倍稀释，制成一定浓度的菌悬液备用。

1.4.4 待测样品制备

①将待测样品牛肉酱、红油分别至于沸水中煮沸10 min[5]，混匀，分装于无菌均质带中，各制备4袋，每袋100 g，备用。②吸取上述4种制备好一定浓度的菌悬液，分别加入盛有待测样品的无菌均质带中，用拍打式均质器进行均质处理2～3 min，备用。

1.4.5 样品检测

将待测样品和空白对照依据GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》和GB 31644-2018《食品安全国家标准 复合调味料》中菌落总数的检测方法进行测定[6-7]，用已加入菌悬液的样品进行检验，每组做2个平行试验，按要求培养24～48 h后，记录检测数据。

1.5 微生物致病菌检测依据

①菌落总数的测定。依据GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》。②大肠埃希氏菌的测定。依据GB 4789.36-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验》。③沙门氏菌的测定。依据GB 4789.4-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》。

④金黄色葡萄球菌的测定。依据GB 4789.10-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》。⑤副溶血性弧菌检测。依据GB 4789.7-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》。

2 结果与分析

2.1 前处理条件优化

吐温80与0.85%的生理盐水按不同比例混合后，它的化学特性在不同的条件下发生反应。pH值是影响菌落生长的一个重要因素，所以在选择优化比例的过程中需特别注意混合灭菌后水溶液的pH值和溶液状态，由表1知，混合稀释液在未调节状态下本身的PH值偏低，灭菌后需调节它的pH值至7.3±0.2，比例为1.0%～5%的混合稀释液的效果最佳。用0.85%生理盐水进行待测样品的稀释，在未添加吐温80的条件下，油水很难混匀，吸出的1 mL样品和培养基也不相容，在逐步添加吐温80后，乳化效果明显，并有良好的稳定性，对含油脂>20%的试验样品来说，选择2.5%～5%的混合稀释液乳化状态最佳，可有利于试验的操作。

2.2 样品乳化试验结果

乳化后样品维持时间的长短，反应了混合后稀释液乳化稳定性的强弱，乳化维持时间越长，说明样品中的油脂被乳化效果更好。通过进行乳化试验对比，2种待测样品在稀释液中添加比例为2.5%、5%、8%和10%都可达到乳化效果。但8%及10%的比例中吐温80的含量较高，经高温灭菌后，常温下极易水乳分层，影响实验过程。因此，选择吐温80混合稀释液为2.5%和5%进行微生物检测试验。

2.3 试验菌性能确认

每种菌株都有它独特的性能，通过分离、纯化后，采用生化试剂鉴定盒和血清能清晰分辨出它的性能变化。菌液浓度是反应每种菌株活力强弱的直观表现，纯度高，繁殖旺盛的菌浓度都在107 CFU·mL-1以上。从-80 ℃冰箱取出4株2代的试验用标准储备菌株，通过营养肉汤在36 ℃，培养24 h条件下进行复壮，依据检测方法选择特定的培养基进行分离，并选取单菌落进行菌株的性能确认和活性检测，结果表明，选取的2代标准储备菌株的性能都能符合要求，菌株的活性也强，达到107 CFU·mL-1，这4株不同的菌株均可正常用于本次试验用菌种。

2.4 微生物致病菌检测影响试验

通过微生物的常规细菌培养法进行检测和分析，在2.5%、5%的吐温80水溶液下进行微生物致病菌的菌含量检测，与空白对照对比，结果发现，大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌4种标准菌株菌含量均不受混合稀释液的影响。由表2、表3知，5%比例的混合稀释液更适合这次试验用的样品，菌含量与对照液更接近。

2.5 实际待测样品测定

经高温煮沸后的2种待测样品进行菌落总数测定，检测值均<10 CFU·mL-1 ，该样品符合试验要求。

3 结论

本试验选用的即食调味品含有2种及以上油类成分，每包含油比例超过20%，通过优化前处理过程，添加5%吐温80制备生理盐水稀释液，可有效地提高油脂类产品微生物检测的准确度，实现了油水混溶的检测方法。该方法操作简单，成本低，可适用于常规实验室检测。但吐温80的稳定性和乳化性受多种条件的影响，应选择纯度更高，杂质更少的分析純或纯度更高的吐温80，在添加的比例上，也需考虑产品的含油量，选择合适的添加量。

参考文献：

[1]Jamie T，Allan S. Empirical molecular modeling of suspension stabilization with polysorbate 80[J].Molecular Simulation，2008，34（10-15）：1353.

[2]王庆利，彭 健.吐温80的安全性研究进展[J].毒理学杂志，2006（4）：262-264.

[3]Deechongkit S，Wen J，Narhi L O，et al.Physical and biophysical effects of polysorbate 20 and 80 on darbepoetin alfa[J].Journal of Pharmaceutical Science，2009，98（9）：3200-3217.

[4]田金秋，张 萍，郑大威，等.Tween80与Span80在食品添加剂微生物学检验中的应用[J].中国农学通报，2012，28（33）：307-310.

[5]兰 兰.家庭消毒方法种种[J].农电管理，2000（11）：45.

[6]国家卫生和计划生育委员会 国家食品药品监督管理总局.GB 4789.2-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定[S].北京：中国标准出版社，2016.

[7]国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局.

GB 31644-2018 食品安全国家标准 复合调味料[S].北京：中国标准出版社，2018.