不同乳酸菌对椰子水饮料的发酵特性研究

邵璐滢，刘四新，刘晓兰，蔡坤，李从发，邓健，*

（1.海南大学食品科学与工程学院，海南海口570228；2.海南大学理学院，海南海口570228）

椰子（Cocos nucifera L.）是世界上最重要且生长最 广泛的棕榈科树种，它主要生长于热带和亚热带环境中，是这些地区国家的重要经济植物[1]。椰子水是椰子的液体胚乳，被欧盟果蔬汁饮料工业协会（European Fruit Juice Association，AIJN）认证为一种果汁[2]，主要成分是糖类、矿物质、维生素和氨基酸等，已经有研究证实其在药物和健康领域的作用[3]：抗氧化，改善炎症[4]等，尽管如此，目前对椰子水的加工利用还是研究较少，而且大部分成熟椰子水作为椰肉的加工副产物利用率低[5]，目前由于国内的椰纤果发酵产业已消失，椰子水除很少量被作为“原味椰子鸡”的餐饮店做汤料外、暂无有效途径可进行大规模利用，以致于被倾倒、遗弃既浪费资源又污染环境，是目前海南椰子产业中亟待解决的课题。本研究着眼于天然椰子水富含营养素、是微生物天然培养基的优势，结合乳酸菌的各种健康特性，研究几株不同乳酸菌对椰子水的发酵特性，为乳酸菌发酵椰子水饮料制备提供基础支持。

近几年，国外已有学者对椰子水的加工关注于发酵椰子水饮料的研发，因为椰子水是一种非乳制品基质，特别是对素食主义者和乳糖不耐受的消费者而言，可作为功能性培养饮料的新型载体引入[6]；而且，椰子水无需任何添加就是微生物的天然培养基；发酵果汁的开发已被证明具有相当大的市场价值和消费者接受度[7]。Kantachote等[8]利用植物乳杆菌DW12，Lee等[9]使用嗜酸乳杆菌L10和干酪乳杆菌L26，Giri等[10]用筛选出的干酪乳杆菌L4发酵椰子水研制饮料，结果表明乳酸菌非常适合用来发酵椰子水饮料的制备，而且不同的乳酸菌对椰子水的发酵特性不同，这方面目前国内外的研究都还不全面，无论是公认的加利亚乳杆菌等、还是新分离出来的乳酸菌，用来制备新型发酵椰子水饮料的研究都是有一定价值的。乳酸菌是一类可以促进宿主肠道内的微生态平衡，对宿主健康产生有益作用的活性微生物，具有促进营养物质吸收、缓解乳糖不耐受、降低人体血清胆固醇含量、水解肠胃胀气因子、延长产品保质期等功效[11]。

乳酸菌及其种子液可以转化发酵底物的生化和感官特征，产生各种代谢物，并用微量营养素如矿物质、维生素、氨基酸、益生菌、益生元和消化酶来丰富饮料[12]。近年来，乳酸菌在发酵饮料中应用广泛，以椰子水为基质，相比于乳制品、谷物等，口感更加独特。本研究中所用野生乳酸菌株为前期从自然发酵椰子水和诺丽汁中筛选分离得到，证实有良好的抑菌活性和肠道耐受性，为发酵椰子水饮料的制备提供参考意义，也为提高椰子水的附加值献策。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

椰子水（NCW）：海口市售文昌本地椰子，破壳取水，4层纱布过滤，混匀，迅速分装于洁净矿泉水瓶，置于-21℃冰柜备用，pH5.0左右，可溶性固形物含量5.0～6.0。

乳酸菌株：发酵乳杆菌L20、面包乳杆菌32-2-2、短乳杆菌64-1、植物乳杆菌A33由海南大学食品学院应用微生物学实验室提供；嗜热链球菌IFFI6038、德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6045：广东省微生物菌种保藏中心。

大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌ATCC14082、金黄色葡萄球菌ATCC25923、李斯特菌ATCC19111、铜绿假单胞菌ATCC9027：海南大学食品学院应用微生物学实验室。

有机酸标准品：上海索莱宝生物科技有限公司；白砂糖为食品级；试验所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（1260）：美国安捷伦公司；紫外分光光度计（Evolution 300）：美国赛默飞公司；立式双层恒温培养箱（SKY-2112B）：金坛市盛蓝仪器有限制造公司；pH计（Delta320-S）：梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 接种发酵椰子水饮料工艺路线

种子液制备：从菌种保藏试管斜面上挑取一环菌体接种于MRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养48 h，活化两代后，活化液离心取菌体，用无菌水洗涤2次～3次，制成种子液。

1.3.2 样品的处理和保存

取发酵 0、24、48、72、96 h 时间点的椰子水发酵液50 mL，4 000 r/min低温离心15 min，取上清液进行检测。样品保存于-20℃冰箱备用。

1.3.3 生长曲线的绘制

将种子液按3%接种量接种于50 mL新鲜椰子水中，置于37℃恒温培养箱中培养，每隔2 h测量菌株的生长量OD660 nm值，设置3组平行。以发酵时间为横坐标，生长量OD660 nm值为纵坐标，绘制生长曲线。

1.3.4 理化指标的测定

总酸：参照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》，以乳酸计量；pH值：采用pH酸度计测定；还原糖：采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法。

1.3.5 有机酸的测定

参照Sabokbar等[13]的方法稍作改进，采用高效液相色谱仪测定样品中的有机酸含量。将发酵液样品解冻，4℃、8 000 r/min离心15 min。采用液相色谱仪：安捷伦1260，配有紫外检测仪；色谱柱：安捷伦 Zorbax SB-aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）；色谱条件：流动相：0.02 mol/L磷酸二氢钾（pH=2.50）∶甲醇（体积比）=98 ∶2；柱温：30 ℃；流速：0.6 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：210 nm；洗脱时间：20 min；洗脱方式为等度洗脱。根据保留时间定性并分别配制不同浓度的酒石酸、草酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸和延胡索酸绘制标准曲线。

1.3.6 菌株抑菌活性测试

参照蒋欣容等[14]方法，稍作修改。

指示菌制备：将指示菌分别接种于普通营养肉汤培养基，37℃培养4 h，并用无菌生理盐水调节菌悬液至107CFU/mL。

单层琼脂扩散打孔法[15]：倾注法将制备107CFU/mL的指示菌菌悬液取200 μL倾入冷却至45℃的15 mL营养琼脂培养基（琼脂含量1.8%），轻摇充分混匀后，水平放置待其凝固。在对平板琼脂打孔过程中采用直径为6 mm的无菌打孔器，用无菌镊子取出孔中央菌层培养基，形成直径6mm的圆孔，并向孔内注入50 μL乳酸菌发酵上清液，待测试，以无菌水作为空白对照，放置37℃恒温培养箱培养48 h，观察有无抑菌圈，并测量其抑菌直径，试验设置3组平行。

1.3.7 感官评分

参照GB/T 31121-2014《食品安全国家标准果蔬汁类及其饮料》的相关内容进行品评，具体评价指标见表1。

表1 感官评分细则Table 1 Sensory rating details

续表1 感官评分细则Continue table 1 Sensory rating details

1.3.8 数据处理

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，结果以平均值±标准差（Mean±sd）表示；采用 Origin（Version 8.6）进行作图。

2 结果与分析

2.1 不同菌株发酵椰子水的生长曲线

不同乳酸菌的生长曲线见图1。

图1 不同乳酸菌的生长曲线Fig.1 Growth curves of the different lactic acid bacteria

由图1可知，6种乳酸菌在椰子水中均呈现良好的生长状况，说明椰子水营养成分丰富，适宜乳酸菌生长。其中，短乳杆菌64-1的生长速率显著慢于其他乳酸菌，表明短乳杆菌64-1在椰子水中发酵性能较弱。发酵2 h～12 h，乳酸菌处于对数生长期，生长旺盛；12 h后，德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6045的生长速率显著高于其他菌株，发酵乳杆菌L20、面包乳杆菌32-2-2和嗜热链球菌IFFI6038的生长速率趋于稳定；在发酵12 h～24 h，植物乳杆菌A33的发酵速率显著慢于其他4株箘，发酵乳杆菌L20、面包乳杆菌32-2-2和嗜热链球菌IFFI6038的生长速率基本相同；发酵36h后，植物乳杆菌A33和德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6045的生长速率显著高于其他4株箘。

2.2 不同菌株发酵椰子水过程中总酸的变化

不同乳酸菌发酵对总酸含量的影响见图2。

图2 不同乳酸菌发酵对总酸含量的影响Fig.2 Effects of different lactobacillus fermentation on total acid

由图2可知，椰子水初始总酸含量为（1.10±0.03）g/L，发酵过程中，发酵液的总酸含量一直呈增加趋势，在发酵前期（48 h内），这种趋势较为明显。不同菌种在椰子水中产酸能力不同，在初始总酸含量相同的情况下，在发酵过程中，0～48 h始终保持总酸含量：面包乳杆菌32-2-2＞发酵乳杆菌L20＞德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6045＞植物乳杆菌A33＞嗜热链球菌IFFI6038＞短乳杆菌64-1；发酵48 h后，植物乳杆菌A33发酵椰子水继续产酸。李俊等用乳酸菌发酵苦荞麦苗饮料也得到相似结果[16]。

2.3 不同菌株发酵椰子水过程中pH值的变化

不同乳酸菌发酵对pH值的影响见图3。

图3 不同乳酸菌发酵对pH值的影响Fig.3 Effects of different lactobacillus fermentation on pH

由图3可知，6株乳酸菌发酵椰子水的pH值变化一致，发酵0～24 h，pH值显著下降，之后趋于平稳，处于3.0～3.5之间，pH值：植物乳杆菌A33＜德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6045＜嗜热链球菌IFFI6038＜面包乳杆菌32-2-2＜发酵乳杆菌L20＜短乳杆菌64-1。乳酸菌pH值是发酵特性的重要指标，乳酸菌可以利用椰子水中的单糖产生酸，因此，pH值也可间接反映乳酸菌在椰子水中的生长状况以及乳酸菌作为饮料的发酵菌种的潜质[17]。

2.4 不同菌株发酵椰子水过程中还原糖的变化

不同乳酸菌发酵对还原糖含量的影响见图4。

图4 不同乳酸菌发酵对还原糖含量的影响Fig.4 Effects of different lactobacillus fermentation on reductive sugar

由图4可知，不同乳酸菌发酵椰子水对还原糖含量的影响不同。发酵前期（0～24 h），还原糖含量显著降低；发酵24 h～48 h，还原糖含量依然呈下降趋势，但趋势变化平缓；发酵48 h后，还原糖含量基本趋于稳定。不同菌株消耗糖的能力不同，发酵48 h后，嗜热链球菌IFFI6038和植物乳杆菌A33的还原糖含量约为30.511g/L，短乳杆菌64-1的还原糖含量约为25.692g/L，发酵乳杆菌L20和面包乳杆菌32-2-2的还原糖含量约为11.511 g/L，德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6045为0.34g/L。Lee et.al[9]用嗜酸乳杆菌L10和干酪乳杆菌发酵椰子水48 h，结果表明还原糖含量有消耗，与本试验嗜热链球菌IFFI6038和植物乳杆菌A33发酵结果相近。

2.5 不同菌株对有机酸含量的影响

有机酸不仅是构成发酵液中风味物质的重要前提物质，也是发酵程度的重要指标，影响着发酵液的品质[18]。发酵汁中的有机酸还可促进消化腺的活动，有助于食物的吸收，具有开胃和促进消化的作用[19]。

乙酸有刺激性酸味，其含量过高会使发酵饮料风味协调性降低，不柔和，且引起饮料的苦味和口感硬[20]。酒石酸给人以些许涩感、酸味较强[21]。柠檬酸酸味清爽，口感温和，后苦时间短；琥珀酸的味感较浓，又苦又咸，足以引起唾液的分泌，特征明显，可增加饮料的醇厚感；苹果酸酸度大，但味道柔和，具特殊香味，乳酸是乳酸菌发酵过程中使一部分碳水化合物代谢所生成的非挥发性风味物质[22]。不同菌株发酵椰子水有机酸含量见表2。

表2 发酵椰子水主要有机酸含量Table 2 Organic acids contents of fermented coconut water

有机酸是发酵汁中主要的风味营养物质，其含量高低与发酵产品的品质有密切关系。研究表明发酵后，椰子水的有机酸含量有不同程度的变化，其中柠檬酸和琥珀酸的含量显著增加；植物乳杆菌A33和德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6045发酵椰子水产生少量乙酸；发酵乳杆菌L20、面包乳杆菌32-2-2和植物乳杆菌A33发酵椰子水的乳酸含量高于未发酵椰子水和其他菌株，但不显著。

2.6 不同菌株抑菌活性结果

不同菌株的抑菌圈结果见表3。

表3 不同乳酸菌抑制致病菌的能力Table 3 Resistance ability of different LAB on pathogenicbacteria

由表3可得，不同菌株对不同指示菌的抑制作用存在较大差别，这与蒋欣容等[14]得到的结果一致。表3结果表明，植物乳杆菌A33的抑菌谱较广，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和李斯特菌均有抑制效果；面包乳杆菌32-2-2对大肠杆菌有显著抑制作用，抑菌圈直径为（15.3±0.06）mm，发酵乳杆菌L20和植物乳杆菌A33对沙门氏菌有显著抑制作用，抑菌圈直径分别为为（14.0±1.00）mm 和（15.1±2.15）mm；发酵乳杆菌L20、面包乳杆菌32-2-2、植物乳杆菌A33和德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6045对金黄色葡萄球菌有较强抑制作用。

2.7 乳酸菌发酵椰子水pH值和乳酸含量与抑菌活性的相关性分析

发酵椰子水pH值和乳酸含量与抑菌活性的相关性分析见表4。

如表4所示，乳酸菌发酵椰子水对指示菌的抑菌效果与酸度（pH值和乳酸含量）相关，乳酸菌发酵椰子水对大肠杆菌的抑制率与pH值呈极显著负相关；对金黄色葡萄球菌的抑制率与pH值呈显著负相关，与乳酸含量呈显著正相关；对沙门氏菌的抑制率与乳酸含量呈极显著正相关。试验结果与戴梓茹等[23]研究酸杨桃发酵液pH值和有机酸与抑菌活性呈显著相关结果类似。

表4 发酵椰子水pH值和乳酸含量与抑菌活性的相关性分析Table 4 Correlation analysis between pH value，lactic acid content and antibacterial activity of fermented coconut water

2.8 不同菌株对发酵椰子水感官评价的影响

因为椰子水是微生物的天然培养基，所以易受污染，目前超高温（ultra high temperature，UHT）工艺和罐装是世界市场上广泛用于椰子水的热处理方式[24]，高温灭菌后的椰子水会产生蒸煮味或红糖味并且椰子水的颜色由无色透明转变为红色至黄色，这是因为糖在高温加热的过程中会发生美拉德反应或焦糖化反应，目前市场上多数椰子水产品都存在这一问题。而乳酸菌发酵后产生的独特的发酵香气，可以减少椰子水原本的蒸煮味给部分消费者带来的不适感。

不同乳酸菌株发酵椰子水的风味不同，试验邀请20位专业人士从气味、色泽、滋味、组织状态以及个人喜好度这5个角度对发酵椰子水饮料进行感官评分，结果如图5所示。

图5 不同乳酸菌对椰子水感官品质的影响Fig.5 Effects of different lactic acid bacteria on sensory quality of coconut water

从总分来看，植物乳杆菌A33、德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6045和嗜热链球菌IFFI6038显著高于其他菌株；可能是因为发酵乳杆菌L20和面包乳杆菌32-2-2涩感较重，且酸味刺激喉咙，让人不悦；短乳杆菌64-1发酵能力较差。

3 结论

研制发酵椰子水饮料的一大重点就是选择合适的发酵菌株，试验结果表明椰子水经不同乳酸菌发酵后成分和抑菌活性以及感官均发生显著变化。发酵48 h后各项指标趋于稳定：植物乳杆菌A33和德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6045在椰子水中生长活菌数最多；面包乳杆菌32-2-2产酸最多，达10.85 g/L；植物乳杆菌A33和德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6045 pH值降到最低为3.1；德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6045还原糖几乎消耗完全；有机酸含量均显著增加，其中柠檬酸增加最为显著；植物乳杆菌A33的抑菌谱较广；植物乳杆菌A33、嗜热链球菌IFFI6038和德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6045发酵椰子水感官评分较高。本研究为解决椰子水作为加工副产物被浪费的问题献策，也为研制风味良好又有营养价值的发酵椰子水饮料提供理论支持。