清心安神丸质量标准研究

杨 琳，王海峰，张 红，党秋萍

1.陕西省杨凌示范区医院(杨凌 712100)；2.武警陕西总队医院(西安 710054)；3.陕西省中医药研究院(西安 710003)

清心安神丸源于陕西省中医医院中医内科协定处方，主要由黄连、川芎、栀子等14味药物组成，有较好的宁心除烦，养阴安神疗效。方中黄连清热燥湿、川芎活血行气止痛、栀子泻火除烦，是除烦安神的主药[1-3]。为了控制好制剂质量，确保其临床疗效，我们对其分别进行了定性定量分析，为清心安神丸的质量控制提供了参考。

资料与方法

1 仪 器 Agilent Technologies 1260 InfinityⅡ,1260VWD检测器，Control Panel工作站，超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)、电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司，d=0.1 mg、d=0.01 mg)。

2 试 药 清心安神丸(陕西省中医医院制备，批号：180401、180402、180403)；黄连、川芎、栀子苷(均购于中国食品药品检定研究院，批号分别为：120913-201310、120918-201110、110713-201212、110749-201718)；甲醇购自Fisher公司，其它试剂购自国药集团，制剂所用药材购自陕西省中医医院药剂科。

3 薄层色谱鉴别

3.1 黄连：取本清心安神丸样品4 g，研细，加甲醇30 ml，超声提取30 min，滤过，滤液作为供试品溶液[4-7]。再按上述方法制备缺黄连的阴性对照溶液。对照品采用黄连对照药材：黄连对照药材溶液(取样量为0.25 g)，按上述方法制备。取上述3种溶液，点于硅胶G板上，点样量为2 μl，展开剂为：环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)，展开前用浓氨溶液预饱和20 min，紫外光灯(365 nm)下检视。结果：清心安神丸样品色谱中检出黄连，阴性对照无干扰(图1)。

3.2 川芎：取本清心安神丸样品6 g，研成细粉，加乙醚30 ml，加热回流1 h，滤过，挥干乙醚，残渣加乙酸乙酯2 ml使溶解，作为供试品溶液[8-9]。再按上述方法制备缺川芎的阴性对照溶液，另取川芎对照药材1 g，按上述方法制成川芎对照药材溶液。分别吸取样品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各10 μl，点于硅胶G薄层板上，展开剂：正己烷-乙酸乙酯(3∶1)，置紫外光灯(254 nm)下检视。结果清心安神丸供试品色谱中检出川芎，阴性对照无干扰(图2)。

3.3 栀子：取本清心安神丸样品13 g，粉碎成细粉，至锥形瓶中，加甲醇40 ml超声20 min，放凉滤过，滤液水浴蒸干，加水20 ml溶解，用水饱和的正丁醇提取，蒸干，加无水乙醇适量溶解后与3 g中性氧化铝拌匀，加于中性氧化铝柱顶(内径d=1 cm，长12 cm)，用30 ml甲醇洗脱，收集，水浴蒸干，加1 ml甲醇溶解，作为供试品溶液[10-12]。再按上述方法制备缺栀子的阴性对照溶液。以栀子苷对照品甲醇溶液(4 mg /1 ml)为对照。分别取样品溶液、阴性对照溶液、对照品溶液各2 μl，点于硅胶G薄层板，展开剂：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)溶液置于冰箱中，冷藏过夜，取下层溶液作为展开剂展开，显色剂用10%硫酸乙醇溶液，105℃加热显色至斑点清晰。结果显示，清心安神丸供试品色谱中检出栀子苷，阴性对照无干扰(图3)。

4 HPLC法测定栀子苷含量

4.1 栀子苷对照品溶液：精密称取栀子苷对照品5.1 mg，加100 ml甲醇溶解(0.051 mg/ml)，备用。

4.2 样品及阴性对照品溶液：取清心安神丸适量，粉碎成细粉，精密称取1.25 g，置锥形瓶中，精密加甲醇40 ml超声20 min，放凉后用甲醇补重，摇匀滤过，精密量取10 ml续滤液，水浴蒸至约1 ml，与1 g中性氧化铝拌匀，干燥，加于中性氧化铝柱顶(内径d=1 cm，长12 cm)，以70%甲醇50 ml洗脱，收集，水浴蒸干，加甲醇转移至10 ml容量瓶中，加溶剂至刻度，摇匀滤过备用。同法制备阴性样品溶液。

4.3 色谱条件：Kromasil C18色谱柱；流动相：甲醇-水(30∶70)；流速为1.0 ml/min；检测波长：238 nm。理论塔板数按栀子苷峰计算大于3000[13]。

4.4 阴性对照实验：分别取样品溶液、阴性对照溶液、对照品溶液各10 μl，按上述色谱条件检测，结果：清心安神丸样品HPLC图谱中，栀子苷色谱峰分离良好，阴性对照无干扰(图4-6)。

结 果

1 线性关系考察 精密量取上述栀子苷对照品溶液，分别精密吸取2、4、6、8、10 μl，测定。结果：栀子苷在 0.102～0.510 μg范围内线性关系良好，回归方程为Y=2147.2X-0.2277，r =0.9999(Y：峰面积，X：进样量)。

2 精密度试验 取上述栀子苷对照品溶液10 μl，浓度为0.051 mg/ml，重复进样6次，结果栀子苷峰面积RSD为0.79%。

3 重现性试验 上述供试品溶液，在上述色谱条件下测定，测得栀子苷含量RSD为1.23%，表明该方法重现性良好，在样品中含量为0.5049 mg/g。

4 稳定性试验 取新制备的供试品溶液10 μl，测定10 h内稳定性(每隔2 h测定1次)，结果栀子苷峰面积RSD在10 h内为0.595%。

5 加样回收率试验 精密称取清心安神丸(含量为0.505 mg/g)细粉六份，每份约0.6 g，分别加入栀子苷对照品溶液(0.051 mg/ml)4.8、4.8、6、6、7.2、7.2 ml，按样品溶液制备方法处理，测定，结果见表1。

表1 栀子苷回收率试验结果(n=6)

6 样品测定 取三批样品，按上述样品制备方法处理样品，测定结果见表2。

表2 清心安神丸样品含量测定结果(mg/g)

讨 论

黄连的薄层鉴别试验，黄连药材中含有[14]：①生物碱类：黄连碱、巴马丁、药根碱、小檗碱、表小檗碱等生物碱类，在黄连总生物碱中含量高达80%左右，主要是原小檗碱型，其中小檗碱为黄连主要成分。还有一些生物碱类只存在于少量的品种中，并且含量不高，比如甲基黄连碱、木兰碱等。②脂类：从黄连植物中分离得到了反式阿魏酸对羟基苯乙酯和落叶松脂素。③多糖类。盐酸小檗碱是黄连药材中主要有效成分，因此以黄连、盐酸小檗碱为对照，对方中黄连进行鉴别。按正文方法进行试验，供试品色谱中，各斑点显色清晰，分离度良好，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；再按处方比例和样品制备工艺制成缺黄连阴性对照样品，按正文方法进行试验，结果阴性对照未见干扰，故将该方法收入标准正文。

川芎的薄层鉴别试验，川芎药材中含有[15]：①挥发性成分：藁本内酯(Ligustilide，58.00%)、3-丁叉苯酞(3-butylidene,phthalide，5.29%)香桧烯(Sabinene，6.08%)，其它成分有：α-蒎烯(α-Pinene)、莰烯(Camphene)、月桂烯(Myrcene)。②苯肽衍生物：川芎内酯(Cnidiumlactone)，川芎酚(Chuanxingol)。③双苯肽衍生物：﹙Z，Z′﹚-二藁本内酯[(Z，Z′)-diligustilide]等。④生物碱：川芎嗪(Chuanxiongzine)，佩洛立灵(Perlolyrine)，腺嘌呤和腺苷。⑤有机酸类：阿魏酸、棕榈酸、叶酸、咖啡酸、原二茶酸、香草酸等。⑥有机酸酯类：苯乙酸甲酯、瑟丹酸内酯、十五酸甲酯。川芎药材成分复杂，特征性成分不明显。因此以川芎药材为对照，对方中川芎进行鉴别。按正文方法进行试验，供试品色谱中，各斑点显色清晰，分离度良好，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；再按处方比例和样品制备工艺制成缺川芎阴性对照样品，按正文方法进行试验，结果阴性对照未见干扰，故将该方法收入标准正文。

栀子的薄层鉴别试验，栀子药材中含有[16]：①环烯醚萜类，如栀子苷,京尼平苷(Geniposide)、京尼平龙胆二糖苷(Genipingentiobioside)、京尼平苷酸(Geniposidic acid)；②西红花苷类，如西红花苷，西红花酸；③另外还含有黄酮类成分。栀子苷是栀子药材中主要有效成分，因此以栀子苷为对照，对方中栀子进行鉴别。方法一：参照(《中国药典》2015年版一部)栀子鉴别项下的方法，取本品13 g，研细，加50%甲醇20 ml，超声处理40 min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取栀子苷对照品，加甲醇制成每1 ml含4 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液6 μl，对照品溶液2 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素纳为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)为展开剂,展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，略显相同颜色的斑点，且分离度不理想。方法二：参照(《中国药典》2015年版一部)泻肝安神丸鉴别栀子项下的方法，即正文方法。按正文方法进行试验，供试品色谱中，各斑点显色清晰，分离度良好，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；再按处方比例和样品制备工艺制成缺栀子阴性对照样品，按正文方法进行试验，结果阴性对照未见干扰，故将该方法收入标准正文。

含量测定指标选择：在清心安神丸含量测定之前，对指标的选定进行了预实验，首先对处方中的君药生地黄、臣药栀子的含量测定指标进行了筛选，结果发现生地黄中梓醇成分由于保留时间过小(在5 min以内)，无法与样品中杂质峰分开，故不能用作质量控制指标。栀子为臣药，栀子苷含量测定经预试发现流动相简单，样品分离度好，峰形理想。故最终选择栀子药材中的栀子苷作为制剂质量控制指标。

色谱条件选择：栀子为方中臣药，栀子苷为其主要

有效成分，因此采用HPLC法建立其含量测定方法，检测波长采用《中国药典》中“栀子”项下波长，流动相采用甲醇与水溶液，对比例进行反复调整，以拖尾因子、分离度、理论塔板数、基线作为评判标准，最终选取甲醇-水(30∶70)为流动相[17]。并进行方法学考察，结果显示，精密度、重现性及回收率均良好，样品在10 h内稳定，可用于清心安神丸中栀子苷的检测标准。

提取溶剂选择：考察60%、70%、80%甲醇作为洗脱剂时栀子苷的含量分别为0.4646、0.4937、0.4942 mg/g。由此可见用80%甲醇洗脱和用70%甲醇洗脱栀子苷得量差别不大，故选择用70%甲醇洗脱。

综上所述，本研究建立了清心安神丸中黄连、川芎、栀子的TLC鉴别方法，并对该制剂中栀子苷含量进行测定并对方法学进行了考察。本研究所建立定性定量鉴别方法简单，专属性、耐用性好，可用于清心安神丸的质量控制。