四君子加川牛膝方对大鼠下肢难愈性创面血小板衍化生长因子表达的影响*

王 鹏，刘 欣，郭树豫，王云飞△

1.上海交通大学附属仁济医院南院血管外科(上海 200000)；2.上海中医药大学附属龙华医院中医外科(上海 200032)

难愈性创面是外科的常见病，占外科总住院人数1.5%～3%[1-2]，中医药促进创面愈合具有悠久的历史，龙华医院顾氏外科早在上世纪七八十年代，就开始了对慢性难愈性创面的临床[3-4]及实验[5-7]研究，相关研究发现中医药可以有效促进创面愈合，对难愈性创面有良好的疗效。我们运用“四君子加川牛膝方”治疗下肢创面取得了一定的治疗效果[8-9]，并开展了相应的机制研究，进一步探讨其促进难愈性创面愈合的机制。

材料与方法

1 实验动物 实验动物取雄性SD(Sprague-Dawly)大鼠，SPF级别，64只，平均体质量为(234.05±26.91)g，均为12周龄。该实验动物由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。许可证号(实验动物)：SCXK(沪)2008-0016。

2 主要试剂及仪器 本研究参考《太平惠民和剂局方》中“四君子汤”，由党参、茯苓、白术各9 g，甘草6 g组成。该中药委托本院制剂室制备。中药按照传统工艺制成水煎剂，依据《中药药理研究方法学》进行人鼠等效剂量换算，为2.97 g/kg。同时将水煎剂进行减压浓缩，浓度为0.30 g/ml。而四君子加川牛膝方，则由党参、茯苓、白术各9 g，川牛膝30 g，甘草6 g组成，换算人鼠等效剂量是5.67 g/kg，减压浓缩至0.57 g/ml。川牛膝方是由川牛膝30 g组成的，人鼠等效剂量是2.7 g/kg，减压浓缩至0.27 g/ml。戊巴比妥钠(Sigma公司，批号为20100312)；大鼠血小板衍化生长因子(Platelet derived growth factor，PDGF)的ELISA试剂盒，批号201501231，来源上海西唐生物。柠檬酸钠缓冲溶液，批号BYL40864，来源上海基尔顿公司；PBS，批号BYL40657，来源上海基尔顿公司；二甲苯，批号10023418，来源上海国药集团；苏木精，批号H8070-5，来源上海索莱宝生物。胎牛血清，批号10099-141，来源Gibco；0.25%胰蛋白酶，批号BYL40926，来源上海基尔顿公司；BCA蛋白定量试剂盒，批号PICPI23223，来源thermo；蛋白预染Marker，批号SM1811，来源Fermentas；NC膜，批号HATF00010，来源millipore；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，批号G2003，来源于谷歌生物。

芬兰雷勃酶标仪，型号MK3；微量高速离心机(国产)；吉尔森P型移液器(Pipetman)；隔水式恒温培养箱(国产)；Leica(莱卡公司)水浴锅，型号HI1210；吉尔森P型移液器(Pipetman)，型号 P20。

3 实验方法 参照文献[10-11]进行动物造模，实验前12 h开始对实验大鼠进行禁食，但给予定量饮水。实验当天测量大鼠体重，单次腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液进行实验动物的麻醉(麻醉剂量按40 mg/kg体质量换算)。麻醉满意后，完成大鼠造模区备皮及标记，予电推剪于右侧臀腿部位剃毛，并用直径25 mm的塑料瓶盖局部标记。在无菌条件下用手术剪沿标记在备皮部位剪开，做直径为25 mm的圆形全层皮肤缺损，后腹腔注射氢化可的松琥珀酸钠(按照80 mg/kg体质量换算)，完成下肢难愈性创面大鼠的动物造模。

4 动物分组、处理及取材 将模型大鼠64只随机分为四组：四君子汤组、四君子加川牛膝方组、生理盐水组、川牛膝组，每组均为16只。实验大鼠分笼单独饲养。造模后次日灌胃给药，四组实验大鼠依次给予四君子汤中药、四君子加川牛膝方中药、生理盐水、川牛膝，每日 1次，每次2 ml。四组实验大鼠均于造模后，每日1次创面清洁换药。换药前1∶5000呋喃西林溶液清洁创面，单层生理盐水纱布湿敷，两层无菌干纱布覆盖，胶布固定。

每组16只动物随机分成2批。分别于造模后的第7天、第14天进行取材。麻醉方法同上，单次腹腔内注射戊巴比妥钠(按40 mg/kg换算)。麻醉满意后，用眼科手术剪取创缘0.5 cm以内少量肉芽组织。立即放入冻存管内，超低温冰箱保存。同时行腹主动脉抽血，每只大鼠抽取8 ml血液，放入抗凝管，超低温冰箱保存。

5 PDGF检测 蒸馏水按1∶10倍将标本稀释液稀释。测定前用标本稀释液按1∶5倍稀释血清。在使用前，将标准品液加入1 ml蒸馏水混合均匀，配制成20 ng/ml的溶液。取1.5 ml离心管8个，在第一管中加入标本稀释液900 μl，在第二至第八管中分别加入标本稀释液500 μl。在第一管中加20 ng/ml的标准品溶液100 μl，后将溶液置于漩涡混合器上，混合均匀，并予加样器吸出500 μl，将此溶液移至第二管。同法反复进行对倍稀释，最终从第七管中吸出溶液500 μl弃去。将第八管作为空白对照组。将标准品或待测样品100 μl依次加入每个孔中，充分混合均匀，37℃下放置40 min。充分洗涤反应板，并在滤纸上印干。将蒸馏水和第一抗体工作液各50 μl加入每个孔中，反应板混匀后，并置37℃ 20 min。充分洗涤反应板5次，滤纸上印干。将酶标抗体工作液100 μl加入每个孔中。将反应板置37℃10 min。再次充分洗涤反应板5次，滤纸印干。每孔分别加入底物工作液100 μl，放置37 ℃暗处进行反应15 min。后每孔加入100 μl终止液，并进行混匀。30 min内通过酶标仪在450 nm处检测吸光值。将所有的OD值减除空白值之后，再进行计算。将标准品不同浓度作为横坐标，OD值作为纵坐标，通过软件作图，描绘出标准曲线。依据样品的OD值计算相应PDGF的含量，再乘上稀释倍数。

6 统计学方法 应用SPSS 17.0统计学软件。正态分布的数据组间比较采用方差分析，以均数±标准差表示。P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 各组肉芽组织HE染色结果 造模后第7天创面肉芽组织HE染色，生理盐水组血管生成较少，成纤维细胞较少；四君子加川牛膝方组，血管生成中度，成纤维细胞中度；四君子汤组，成纤维细胞较多；川牛膝组，成纤维细胞较大，新生血管较少(图1)。

造模后第14天创面肉芽组织HE染色，生理盐水组新生血管中度，成纤维细胞中度；四君子加川牛膝方组，成纤维细胞中度,新生血管较多；四君子汤组，新生血管中度，成纤维细胞中度；川牛膝组，新生血管较多(图2)。

A:生理盐水组；B:四君子加川牛膝方组；C:四君子汤组；D:川牛膝组

A:生理盐水组；B:四君子加川牛膝方组；C:四君子汤组；D:川牛膝组

2 各组大鼠PDGF浓度比较 见表1。在造模后第7天，四君子汤组、四君子加川牛膝方组与生理盐水组比较，PDGF表达明显增高(F=4.30,P<0.05)；川牛膝组与生理盐水组比较，两组PDGF无统计学差异(P>0.05)；四君子汤组与四君子加川牛膝方组的PDGF表达无统计学差异(P>0.05)。

造模后第14天，四君子汤组、四君子加川牛膝方组、川牛膝组、生理盐水组，组间比较，PDGF表达水平无统计学差异(F=0.85，P>0.05)。

表1 各组大鼠PDGF浓度比较(mg/ml)

注：与生理盐水组比较，*P<0.05；与川牛膝方组比较，△P<0.05

讨 论

下肢难愈性创面属中医“溃疡”、“臁疮”范畴。早于唐医书中即有记载，《华佗神医秘传·论痈疮》云：“臁疮有内、外之异，因脏腑中有湿毒，乃外发为疮，亦有因打仆抓磕，或遇毒虫恶犬咬破损伤，因而成疮者。”中医学对下肢难愈性皮肤溃疡的治疗历史悠久，疗效良好，历代医书都对此做过阐述，并在临床经验、方药剂型的基础上，发展形成理论，构成了独特的理论体系。上海中医药大学附属龙华医院中医外科，传承顾氏外科，认为下肢难愈性皮肤溃疡难以愈合的根本原因是“虚”,即正气虚损[10]。我们认为下肢皮肤溃疡创面“腐肉已脱”，肉芽色暗红“新肉不生或难生”，经久难愈合；并且患者年高，多脏腑功能失调，正气不足，故而肤失荣养。同时中医“脾主肌肉”、“脾为气血生化之源”、“脾主运化”的理论强调，全身肌肉都依靠脾胃运化的水谷精微化生气血来营养，并促进创面肉芽组织生长，修复组织缺损[11]。因此在治疗方面，尤其重视“益气健脾”。在分期辨证论治的基础上，将“益气健脾”贯穿治疗始终，治疗不同阶段侧重略有不同。

四君子汤是健脾益气的经典代表方剂。宋朝《太平惠民和剂局方》中记载了“四君子汤”，由人参、白术、茯苓、甘草四味药物组成，该实验研究以党参代替人参。该方平和稳妥，遵从“君子致中和”的古意，故方名四君子。《医方集解》云此方 “人参甘温，大补元气，为君。白术苦温，燥脾补气，为臣；茯苓甘淡，渗湿泻热，为佐。甘草甘平，和中益土，为使也。气足脾运，饮食倍进，则余脏受荫，而色泽身强矣。”自古牛膝作为引经药，医家认为其“引药下行”，历代本草均有论述。如《本草经疏》提出牛膝“性善下行”，并擅长 “病在下”疾患的治疗。四君子加川牛膝方，以补虚生肌为治疗原则，加川牛膝为引经药以引药下行，促使药力直达病所，促进创面愈合。前期研究发现[12-13]，四君子汤加引经药川牛膝，可提高创面的愈合速度，有效治疗下肢皮肤溃疡。

本实验结果显示，造模后第7天，创面肉芽组织HE染色，四君子汤组，成纤维细胞较多；生理盐水组血管生成较少，成纤维细胞较少。与此同时造模后第7天，PDGF的表达，四君子汤组明显高于生理盐水组。

创面修复是将损伤组织结构的完整性进行修复和恢复的过程，包括了炎症反应、细胞增殖和创面重建等几个阶段，主要包括：新生毛细血管生长、成纤维细胞增殖分裂、细胞外基质纤维化以及表皮细胞增生覆盖创面[14]，最终完成再上皮化或者形成瘢痕。皮肤损伤，由于其存在严重的真皮缺损，需要先形成肉芽组织以填补缺损，这是整个创面修复过程中的最先环节，也是关键环节。而肉芽组织是由成纤维细胞与毛细血管共同组成的，因此成纤维细胞在创面修复中发挥重要的功能，其在创面愈合过程中起到迁移、增殖、分泌基质成份以及胶原纤维的作用，并且分泌多种细胞因子参与创面愈合。成纤维细胞与新生的毛细血管等共同构成肉芽组织，填补了组织缺损，为表皮细胞创造条件，促进创面愈合。因此成纤维细胞能否正常增殖，对促进创面愈合、维护机体功能，发挥了重要的作用。成纤维细胞的增殖能力成为反映其参与组织修复能力的重要指标。本次实验结果表明，在造模后第7天，创面肉芽组织HE染色提示，四君子汤组，成纤维细胞较多；生理盐水组血管生成较少，成纤维细胞较少。

PDGF是一种间接或直接的参与创面愈合的生长因子，参与细胞和组织的增殖与分化等过程，具有广泛的生物学活性，在创面修复过程中起关键调控作用[15]。在创面修复过程中，创面或其周围组织细胞可以通过旁分泌或者自分泌产生PDGF，而PDGF则可间接或者直接的参与组织及血管的修复，从而对创面的修复起调控作用。PDGF与细胞膜表面的受体结合后，可以通过受体的介导，激活细胞内MAPK信号转导途径，导致一系列连锁反应。PDGF能促进成纤维细胞的增殖，并促进其分泌细胞外基质，在创面愈合过程中起关键调控作用。PDGF还可趋化单核细胞、中性粒细胞以及成纤维细胞，促使这些细胞迁移至创伤部位；PDGF 作为成纤维细胞的有丝分裂原，对成纤维细胞的再生具有诱导作用，能够增加肉芽组织中成纤维细胞的含量；同时PDGF 在体内还可激活巨噬细胞，促使巨嗜细胞合成血管内皮生长因子，从而促进血管新生，加速创面愈合。

中医认为下肢皮肤溃疡存在“腐去肌生”、“肌平皮长”的愈合阶段，与之相类似，西医学认为创面的愈合，先后经历“炎症反应期”、“肉芽增生期”、“上皮形成期”过程。因此我们针对难愈性创面“腐肉已脱，新肉不生或难生”阶段，依据中医“补虚生肌”、“脾主肌肉”的理论，应用益气健脾中药四君子汤以促进肉芽组织生长，填充组织缺损，促进创面愈合。在造模后第7天创面以肉芽增生为主，补虚生肌类中药四君子汤，通过上调PDGF等细胞因子的合成和分泌，PDGF通过趋化作用使单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等向损伤部位聚集，利于创伤早期炎症消退；同时PDGF能促进成纤维细胞、血管内皮细胞的增殖与分化[13-14]，从而促进肉芽组织的生长，填充组织缺损；趋化角化细胞迁移，缩小创伤体积，并加速内皮细胞损伤修复，提高愈合速度。而造模后第14天，前期研究证实四君子汤组大鼠创面愈合平均时间为17.74 d，在造模后第14天，此时创面以“上皮化”为主，四君子汤益气健脾促进肉芽增生作用起效甚微，故而对PDGF影响不大，与生理盐水组比较无明显差异。