柔筋止颤片通过抑制ROS通路减轻MPP+诱导SH-SY5Y 细胞凋亡实验研究*

张 伟，林 海，常 翔，杨 琳，吕富荣，左 瑞，田 兵

西安市中医医院脑病科(西安 710021)

帕金森病(Parkinson's disease,PD)的病理表现为中脑黑质致密部的多巴胺能(Dopaminergic,DA)神经元显著减少，而残存的 DA神经元内出现嗜酸性包涵体即路易小体，其主要成分为α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)[1]。除遗传因素外，氧化应激和线粒体功能障碍被认为是PD演变的核心环节[2-4]。PD属于中医“颤证”范畴，肝肾阴虚贯穿疾病始终，早期以痰热动风、血瘀动风、肝肾阴虚多见，中期以肝肾阴虚为主，晚期则以肝肾阴虚、阴阳两虚常见[5]。柔筋止颤片由西安市中医医院脑病科自制院内制剂，该药主要由钩藤、珍珠母、龙骨、牡蛎、川牛膝、天麻、白芍、甘草等九味药组成，具有柔肝息风，止痉通络的功效。经过近30年的临床使用，发现其对帕金森病的具有一定的疗效。本实验旨在探讨柔筋止颤片是否能通过抑制ROS通路保护由MPP+诱导的SH-SY5Y 细胞损伤，为其进一步研发提供实验依据。

材料与方法

1 细胞培养 本实验选用人源神经母瘤细胞系SH-SY5Y细胞[6]。培养条件为：温度37℃，CO2含量5%。用于培养细胞的DMEM培养基(Sigma，美国)中含有10%胎牛血清(GIBCO，美国)。实验细胞密度需要达到50%。

2 MTT检测 MTT(Millipore，美国)检测用于检测细胞活性。分组：①正常对照组：不处理；②柔筋止颤片组：柔筋止颤片(25 nmol/L)处理24 h；③MPP+组：MPP+(500 μmol/L)处理24 h；④柔筋止颤片+MPP+组：柔筋止颤片(25 nmol/L)预处理24 h后，经MPP+(500 μmol/L)处理。采用96孔板进行实验，依组处理后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，培养箱中继续孵育4 h。将培养基清除后，每孔加入150 μl二甲亚砜(DMSO)，避光置入酶标仪读数器(Bio-Rad公司，美国)，震荡10 min后读数，波长设定为570 nm。细胞活性(%)=检测组值/正常对照组值×100 %。

3 O2-检测 采用DHE(D11347,Life Technologies，美国)检测O2-水平，分组同MTT检测。采用96孔板进行实验，依组分别处理后，加入DHE(5 mmol/L)，室温避光15 min，孵育完毕后用PBS洗3次，每次5 min，避光置入酶标仪读数器(Bio-Rad公司，美国)进行读数。O2-比率(%)=检测组值/正常对照组值×100 %。

4 ROS检测 采用DCFH-DA(D6883,Life Technologies，美国)检测ROS水平，分组同MTT检测。采用96孔板进行实验，依组处理后，加入DCFH-DA(10 μmol/L)，室温避光15 min，孵育完毕后用PBS洗3次，每次5 min，避光置入酶标仪读数器(Bio-Rad公司，美国)进行读数。ROS比率(%)=检测组值/正常对照组值×100 %。

5 Western blot检测 分组同MTT检测，采用6孔板进行实验，处理后的细胞经PBS溶液(4℃)重复冲洗2次，每孔加入1 ml裂解液对细胞进行裂解。蛋白定量后，取15 μg总蛋白经聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行电泳，转移至PVDF膜，置入2 % BSA溶液中，室温下孵育2 h。将PVDF置入一抗Cleaved Caspase-3(9664，CST公司，美国)，Cleaved Caspase-8(9748，CST公司，美国)，Cleaved Caspase-9(52873，CST公司，美国)，β-actin(3700，CST公司，美国)中室温(4 ℃)孵育过夜后，二抗室温(4 ℃)继续孵育2 h。采用全能型凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司，美国)进行成像，Lab Image软件(Kapelan GmbH，德国)进行分析。

结 果

1 柔筋止颤片保护MPP+诱导的细胞活性下降MPP+(500 μmol/L)处理后细胞活性下降至(53.21±12.11)%作为处理条件，差异具有统计学意义(图1)。研究发现，柔筋止颤片处理对于细胞活性没有影响，差异无统计学意义(P>0.05)。柔筋止颤片预处理24 h后，经MPP+处理，可以保护细胞活性维持于(96.78±17.24)%，差异有统计学意义(P<0.05)。

2 柔筋止颤片减轻MPP+诱导的O2-和ROS增多 MPP+处理后O2-和ROS水平升高(3.87±1.01)倍和(4.02±0.53)倍，差异具有统计学意义(图2)。柔筋止颤片处理对于O2-和ROS水平没有影响，差异无统计学意义(P>0.05)。柔筋止颤片预处理24 h后，经MPP+处理，可以保护O2-和ROS水平降低至(1.11±0.19)倍和(1.24±0.23)倍，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 柔筋止颤片调节MPP+诱导的Clevaed Caspase-3,Clevaed Caspase-8和Clevaed Caspase-9表达 MPP+处理后Clevaed Caspase-3,Clevaed Caspase-8和Clevaed Caspase-9表达水平显著升高,差异具有统计学意义(图3)。柔筋止颤片处理对于Clevaed Caspase-3,Clevaed Caspase-8和Clevaed Caspase-9表达水平没有影响，差异无统计学意义(P>0.05)。柔筋止颤片预处理24 h后，经MPP+处理，可以使Clevaed Caspase-3,Clevaed Caspase-8和Clevaed Caspase-9表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 柔筋止颤片调节MPP+诱导的Clevaed Caspase-3,Clevaed Caspase-8和Clevaed Caspase-9表达

讨 论

在高表达突变蛋白α-Syn(A53T)的转基因PD小鼠模型中，A53T能够靶向性的聚集于线粒体膜上，并选择性抑制线粒体复合体I功能，从而引起线粒体膜电位下降，造成ROS的生成过度增加[7]。作为与细胞核同样具有自我复制、转录和翻译的功能的mtDNA，由于缺少保护机制和自我修复机制，可直接被ROS损伤[8]。无法修复的线粒体则通过线粒体自噬进行选择性地清除，以保证细胞功能正常。而在PD中，自噬处于异常状态，导致线粒体损伤处于持续的恶性循环中。

mtDNA虽然具有自我复制、转录和翻译的功能，但由于缺少类似于细胞核中组蛋白和DNA结合蛋白的保护机制和自我修复机制，其直接暴露于氧化磷酸化过程产生的ROS中，因此极易受到损伤而发生突变[9]。此外，由于mtDNA缺少内含子，任何部位发生突变均可影响其所编码的复合物及电子传递链的结构和功能缺陷，而导致ROS生成增加，从而发生恶性循环[10]。

MPP+常用于PD细胞模型的建立，研究发现该品可导致线粒体损伤，并产生大量的包括NO、H2O2、NO-、O2-在内的ROS[11]。我课题组研究发现，抗氧化中药单体(红景天苷、白藜芦醇)可保护MPP+诱导的神经元细胞活性降低，并维持线粒体长度和增加线粒体膜电位水平[12-16]，说明中药在保护神经元免受神经毒性侵袭中具有重大的潜力[17-20]。进而，在本研究中发现，一方面柔筋止颤片预处理可以减少MPP+诱导的细胞活性降低，另一方面柔筋止颤片可能通过维持线粒体形态和正常功能以降低MPP+诱导的线粒体破损继而引发的O2-和ROS水平升高。

当细胞自身无法完成修复且维持正常功能时，则会导致不可逆的细胞凋亡程序启动，并被邻近的吞噬细胞所吞噬。而不管通过何种途径，最终均需通过激活Caspases诱导细胞凋亡[21-24]。内源性途径是以线粒体作为细胞凋亡的调控中心，其损伤后释放出的大量细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子1及Caspase-9结合形成凋亡小体，而被活化的Ccaspase-9则继而激活Caspase-3，引起细胞凋亡[25-30]。外源性途径则是以死亡受体介导的凋亡通路，主要通过活化Caspases-8继而激活Caspases-3，引起细胞凋亡。本研究发现，柔筋止颤片预处理可以显著降低MPP+诱导的Clevaed Caspase-9、Clevaed Caspase-8和Clevaed Caspase-3表达水平升高，提示柔筋止颤片可以通过抑制凋亡蛋白的活化以阻止细胞凋亡的启动和执行。

综上所述，体外实验证实柔筋止颤片可减少MPP+诱导的O2-和ROS水平升高以减少线粒体的损伤，并减少Caspases蛋白的活化以抑制细胞凋亡程序的启动，进而保护MPP+诱导的SH-SY5Y细胞活性降低，为进一步优化柔筋止颤片的研究提供了实验依据。相关研究亦发现中药复方在治疗帕金森病方面具有确切疗效[25]，但是由于中药复方有效成分的复杂性，柔筋止颤片的有效成分分析需要进一步验证。