超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱快速测定天王补心片中五味子醇甲和藁本内酯含量*

史 宁，郭宏举，耿 帅，常李荣

战略支援部队特色医学中心药学部(北京 100101)

天王补心片是由丹参，当归，石菖蒲，党参，茯苓，五味子，麦冬，天冬，地黄，玄参，远志(制)，酸枣仁(炒)，柏子仁，桔梗，甘草，朱砂共16 味中药组成的复方制剂[1]，具有滋阴、养血、补心安神的作用。五味子和当归在本方中作为佐药，主要有益气敛阴养血的功效[2]。五味子醇甲及藁本内酯分别是五味子和当归中的主要活性成分[3-4]。在药典(2015版)药品标准项目中，测定了对天王补心丸中五味子醇甲的含量[5]。另有研究报道，运用高效液相色谱法对天王补心丸其他主要成分，如梓醇、丹参素、丹酚酸B及6 种木脂素的定量进行测定[6-9]，但该方法灵敏度及分离效果有一定的欠缺。本研究首次采用UPLC-Q-TOF-MS方法对天王补心片中两种主要成分五味子醇甲、藁本内酯同时测定，为进一步优化天王补心片质量控制标准提供一定的参考。

资料与方法

1 仪器与试药 Waters超高效液相-四级杆飞行时间质谱系统；赛多利斯BS124S 型电子天平。五味子醇甲，批号Z16M6B1，纯度98%以上，上海源叶生物科技有限公司产品；藁本内酯，批号J1420063，纯度98%以上，上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品；天王补心片，批号分别为150505、150807、160501、160602、160710、170305，重庆巨琪诺美制药有限公司产；质谱级乙腈，批号151902，美国Fisher公司产品。

2 实验方法

2.1 条件：浓度为0.1%甲酸-水溶液I相，浓度为 0.1%甲酸-乙腈为II相；以0.4 ml/min设置流速；5%II～95%II洗脱0～15 min；95%II洗脱15.1～25 min；5%II洗脱25.1～30 min。

2.2 质谱条件：锥孔电压和毛细管电压分别设置为40 V和3.0kV，同时设定为120 ℃的离子源温度，脱溶剂温度和脱溶剂气流速分别设置为500 ℃和800 L·h-1，以亮氨酸脑啡肽进行质量校对，正离子模式，正离子556.2771，选择离子分别为五味子醇甲415.22及藁本内酯191.11。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备：于10 ml量瓶中精密称取适量的五味子醇甲及藁本内酯对照品，甲醇定容后，均匀摇晃使其溶解，即得对照品储备液。于10 ml量瓶中精密量取适量五味子醇甲及藁本内酯对照品储备液，甲醇定容并溶解，所得溶液质量浓度为五味子醇甲0.101 mg/ml，藁本内酯0.200 mg/ml。

2.3.2 供试品溶液的制备：分析天平精密称取天王补心片约500 mg并研细，置于10 ml量瓶内，70%甲醇溶解至8 ml，超声(120W，60Hz)提取60 min，放至室温后70%甲醇定容，均匀溶解后用0.22 μm 微孔滤膜过滤，取上清。

2.3.3 阴性样品溶液的制备：按处方工艺制备不含五味子醇甲及藁本内酯的阴性样品，按供试品溶液的制备方法操作。

结 果

1 专属性考察 分别取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各2 μl进样，正离子扫描模式，记录质谱图，结果如图1所示。阴性样品在五味子醇甲及藁本内酯出峰处无干扰，证明样品中无其他成分干扰测定。五味子醇甲及藁本内酯分别为7.76 min及8.90 min。

A:天王补心片 B:阴性样品

2 线性关系考察及检测限、定量限测定 适量量取上述混合对照品溶液，采用倍数稀释法，用甲醇稀释，配置稀释倍数分别为20、40、80、200、400和800标准溶液，检测条件不变进样，记录各峰面积。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果如表2所示。以信噪比S/N=3 和S/N=10 时，定量限和检测限以各对照品溶液的质量浓度表示，结果如表1所示。

表1 五味子醇甲、藁本内酯样品回归方程、标准曲线、定量限和检测限

3 精密度试验 混合对照品溶液精密吸取后连续进样6次，计算各成分峰面积的RSD，藁本内酯的RSD为5.55%，五味子醇甲的RSD为4.31%，证明仪器具有良好的精密度。

4 重复性试验 按精密度实验所述方法制备6份样品(批号201504042)的供试品溶液分析，所测溶液中各成分平均含量及其RSD分别为五味子醇甲0.38 mg/g及藁本内酯0.36 mg/g，RSD分别为5.09%及3.55%，结果表明该方法重复性良好。

5 加样回收率考察 精密称定500 mg天王补心片并研细，置于10 ml量瓶内，加入8 ml 70%甲醇，超声(120W，60Hz)提取60 min，放至室温。将五味子醇甲和藁本内酯对照品储备液精密加入，甲醇定容后0.22 μm微孔滤膜过滤，取上清液进样测定，计算五味子醇甲及藁本内酯的平均回收率分别为95.33%和97.25%，RSD 分别为3.15%及4.47%。结果表明，两种主要成分回收率在95%以上，符合测定要求。

6 样品测定 5个批号的天王补心片各3份制备供试液，分析和记录色谱峰面积，运用各成分相应的回归方程计算丹五味子醇甲及藁本内酯的含量，结果见表2。

表2 天王补心片中五味子醇甲及藁本内酯的含量(mg/g)

讨 论

天王补心片作为国家基本药物，其标准已收录到国家中成药标准。天王补心片主要包含16味中药，为丹参、当归、石菖蒲、党参、茯苓、五味子、麦冬、天冬、地黄、玄参、制远志、酸枣仁(炒)、柏子仁、桔梗、甘草、朱砂。其中五味子能够清除自由基、提高人体抵抗力，而含量较高的木脂素类成分五味子醇甲是其有效活性成分。当归作为整个方剂中的佐药，具有补血润燥等功效，地位非常重要[10]。因此我们在测定五味子醇甲的同时，又选择了当归中的主要活性成分藁本内酯作为检测对象。

UPLC-Q-TOF-MS 是高分辨串联质谱，具有高分辨率、高灵敏度、高效率的特点，能够对复杂体系的化合物进行快速测定[11-14]。此外相比于高效液相色谱，超高效液相色谱由于色谱柱的固定相粒径更小，分离效果更好，因此能够将天王补心片中这两种成分分开而互不干扰。

该技术早已成熟并在研究中广泛得到证实，鄂秀辉[15]等通过采用UPLC-Q-TOF-MS法分析加参片提取物中14种入血原型成分，主要包括丹参、黄芪、加香皮和三七等。

本实验基于以往经验，首次建立了天王补心片中五味子醇甲和藁本内酯含量检测的超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱快速测定方法，对天王补心片6个批次中五味子醇甲及藁本内酯同时进行定量分析。研究显示，天王补心片中五味子醇甲及藁本内酯的含量均在0.3～0.4 mg/g之间，说明该药中藁本内酯与五味子醇甲含量相近，同时二者的平均回收率分别为95.33%和97.25%，均高于95%，并且RSD值较小，可充分证明此方法精密度高、重复性小、简便快速。藁本内酯与五味子醇甲分别为当归和五味子的主要成分，具有较好的生物活性，该研究为天王补心片的深入研究奠定了较好的试验基础，此方法也为天王补心片生产中五味子醇甲与藁本内酯含量作为质量控制提供参考依据。