香砂六君子汤对脾气虚证浅表性胃炎大鼠线粒体能量代谢影响研究*

倪 菲,于 睿,崔家鹏,王彩霞,袁东超,杨茗茜,李思琦,曲金桥

1.辽宁中医药大学中医学院(沈阳 110847)；2.辽宁中医药大学附属医院西医诊断教研室(沈阳 110032)

中医理论认为脾为“后天之本，气血生化之源”[1]，脾能化生人体的气、血、精、津液，是由于脾从饮食中吸收营养物质，使其输布于五脏六腑，四肢百骸，即“脾主运化”的功能。只有脾的运化功能正常，人体才能进行正常的物质生成与代谢。中医的“脾”不仅是指西医的整个消化系统，而且与多系统、多功能单位有关。琥珀酸脱氢酶(SDH)是线粒体能量代谢三羧酸循环中不可缺少的酶，它在生物体内可以起到催化琥珀酸脱氢从而转变成延胡索酸的作用，并释放出大量能量供机体使用。细胞色素氧化酶C(Cyt-C)，也被叫做呼吸链复合物，它位于呼吸链的末端，起到催化细胞色素氧化的作用，同时驱动其合成，是线粒体的标志酶，其酶活性的发挥对于维持各个部位线粒体结构和功能以及细胞能量的产生有非常重要的意义[2]。香砂六君子汤具有益气健脾的功效[3]，本研究主要观察香砂六君子汤对脾气虚证浅表性胃炎模型大鼠胃窦细胞组织里琥珀酸脱氢酶活性及细胞色素氧化酶C含量的影响，旨在从线粒体能量代谢角度阐明其治疗脾气虚证浅表性胃炎的作用机制。

材料和方法

1 实验动物 从辽宁长生生物技术股份有限公司购买SPF级2月龄雄性健康SD大鼠45只(体重200±20 g)，许可证号为：SCXK(辽)2015-0001。所有大鼠均在购买后进行分笼饲养1周，在不施加任何处理因素条件下给予自由饮水及饮食。动物饲养每天按时给予标准颗粒饲料。实验观察室采取开放形式，温度、照明、噪音与换气等自然饲养条件均严格控制在规定范围内，每日定时进行清洗。

2 主要试剂 SDH试剂盒(批号：BC0955)与大鼠Cyt-C定量检测试剂盒(批号：BC0854)，均购于北京索莱宝科技有限公司。脱氧胆酸钠粉末、2%水杨酸钠溶液与4%多聚甲醛溶液均购自上海金穗生物科技有限公司。

3 仪器及设备 主要仪器采用的是:全自动酶标仪anthos2010(由奥地利安图公司生产)；UV-1801紫外/可见分光光度针(购自北京北分瑞利分析仪器公司)；台式多功能冷冻高速离心机(Stratos，德国赛默飞公司生产)；匀浆器；精密数字电子天平(SETRA，美国)；可调式移液器；荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)；恒温震荡器(杭州奥盛仪器有限公司生产)、制冰机(SANYO公司生产)、水浴锅等。

4 实验方法

4.1 动物分组及模型制备：45只大鼠随机分为正常组(健康组)15只(以下简称正常组)、脾气虚证浅表性胃炎模型组15只(以下简称模型组)、脾气虚证浅表性胃炎模型治疗组15只(以下简称治疗组)。正常组蒸馏水灌胃，每只1 ml/100 g, 2次/d，连续30 d；模型组采用劳倦过度与饥饱失常加强酸刺激等复合因素塑造脾气虚证浅表性胃炎模型，第1～20天每隔5天，灌胃浓度为2%水杨酸钠溶液，每次每只3 ml，并将20 mmol/L的脱氧胆酸钠溶液当作饮料给大鼠们随意饮用；而在第21～30天则分别将20 mmol/L的脱氧胆酸钠2%和水杨酸钠溶液当作饮料交替进行，每隔3天轮换1次，任意给大鼠们饮用，以加强刺激。与此同时，在第21～30天期间进行感染幽门螺杆菌。每次感染前先禁食14～16 h，经口腔缓慢灌注5%的NaHCO33 ml，15 min后灌注幽门螺杆菌菌液3 ml，40 min后给食。每隔5天感染1次，共进行2次。实验第1～30天期间单日喂食甘蓝。15～20 g/只，禁食，自由饮水；游泳至耐力极限(耐力极限系指大鼠游泳至口鼻部首次侵入水中)。双日以猪油3 ml/只灌胃，自由进食、饮水。治疗组造模方法同上，共造模30 d。

4.2 脾虚大鼠模型的评估标准：依据卫生部药政司发布的《关于中药治疗脾虚证的临床研究指导原则》中提到的诊断标准、1986年全国中西医结合虚证老年病防治学术会议制定的“中医虚证辨证参考标准”及《21世纪课程教材-中医基础理论》(李德新主编，2001年版)确定脾气虚模型评估标准：①大便溏泄；②食少纳呆；③消瘦，体重减轻；④神态萎靡，毛色无光泽；⑤蜷缩聚堆；⑥易疲劳。第①、②项为主症，第③～⑥项为兼项，具备两项主症及两项兼症时，即可认为脾气虚造模成功。

4.3 药物干预：治疗组30 d后，以香砂六君子汤(党参20 g，茯苓、白术各15 g，清半夏、陈皮、砂仁、炙甘草各10 g，木香5 g，根据国家炮制标准炮制后，煎煮成汤剂，由辽宁中医药大学附属医院提供)灌胃，4℃保存，用前加热至37℃。每公斤体质量大鼠的给药量为人的6.3倍，并且每次给大鼠灌胃量为正常人给药量的2倍剂量灌服[4]，早晚各1次，连续15 d。正常组和模型组灌服等量蒸馏水，方法同上。

5 指标检测

5.1 琥珀酸脱氢酶(SDH)活性指标检测：在实验45 d后每组大鼠各留取10只，于给药结束后立即处死取材备检。检测前各组大鼠禁食16 h，采取吸入式麻醉后剖开腹腔，迅速剪取距幽门近端约2～3 cm的胃窦组织。各称取1 g放入预冷的蒸馏水中洗去血液后，准确称量0.1 g胃窦组织加9倍生理盐水后，用冰浴匀浆器充分研磨后制成10%的匀浆，4℃11000 g离心10 min后，按照试剂盒明确注明的方法提取上清液放置冰上进行SDH活性检测。

5.2 细胞色素氧化酶C(Cyt-C)含量检测：采取吸入麻醉后，剖开大鼠腹腔，剪取距幽门近端约2～3 cm的胃窦组织，各称取1 g放入预冷的蒸馏水中洗去血液后，加入一定量的PBS(pH7.4)。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2～8℃的温度。在加入一定量的PBS之后(pH7.4)，用匀浆器将标本进行充分的匀浆处理。以2000～3000 r/min的速度离心20 min左右后注意仔细收集上清液按试剂盒说明方法进行细胞色素氧化酶C含量检测。

5.3 胃窦组织HE染色普通光镜下观察病理：大鼠吸入麻醉后，剖腹切取损伤严重的胃窦组织1 cm3,沿大鼠胃大弯处剪幵，平铺，置入装有生理盐水的烧杯中洗涤2次，后用水冲洗干净，切块，投入4%多聚甲醛中固定24 h，20%和30%蔗糖梯度脱水，冰冻，切片，进行常规HE染色，封片，于不同倍数光镜下观察胃黏膜改变。

结 果

1 脾气虚大鼠模型建立的指标观察 脾气虚造模大鼠，造模第5天开始，喂药当日就会出现软便，次日自行恢复。随着造模时间延长，喂药当日则会出现溏便，次日可以见到软便。自造模15 d左右逐渐形成蜷缩聚堆，拱背，萎靡，毛发枯槁，纳呆、怠惰，便溏，个别有黏液便，体重减轻，出现了脾气虚证。22 d以后可见溏便脏尾，懒动，毛枯槁无光泽，进食减少，泄泻，拱背，体重增长缓慢，以上表现持续至造模结束。本实验研究中脾气虚组动物出现各体征及表现与临床脾气虚证具有一定的相似性。正常组大鼠则毛色润泽，进食量大，体重呈自然上升趋势，上述脾气虚症状未出现。说明本实验成功复制了脾气虚证大鼠模型。

2 脾虚浅表性胃炎大鼠病理组织学观察 正常组大鼠胃窦组织黏膜上皮细胞排列整齐，细胞呈单柱状，腺体排列紧密规则，极少见到炎症细胞浸润；模型组胃黏膜上皮细胞受损，表现为排列紊乱，黏膜层可以观察到有大量炎症细胞浸润，部分能看到有成堆的淋巴细胞聚集灶，而胃窦黏膜腺体则表现为排列紊乱；治疗组大鼠胃黏膜的表面上皮细胞受损和炎症细胞浸润情况与模型组相比明显减轻(图1)。

图1 各组大鼠胃窦组织黏膜(HE染色，×100)

3 各组大鼠琥珀酸脱氢酶活性的比较 见表1。三组大鼠于45 d后处死，进行检测，测定胃窦组织的琥珀酸脱氢酶活性，从表1结果可见，模型组大鼠琥珀酸脱氢酶活性显著低于正常组和治疗组，差异具有统计学意义(P<0.05)，治疗组琥珀酸脱氢酶活性显著高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，治疗组与正常组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 大鼠胃窦组织琥珀酸脱氢酶活性比较(U/mgprot)

注：与正常组比较，△P<0.05；与模型组比较，◇P<0.05

4 各组大鼠细胞色素氧化酶含量的比较 见表2。从表2结果可见，模型组大鼠细胞色素氧化酶含量显著低于正常组和治疗组，差异具有统计学意义(P<0.05)，治疗组细胞色素氧化酶含量显著高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，治疗组与正常组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 大鼠胃窦组织细胞色素氧化酶含量比较(nmol/L)

注：与正常组比较，△P<0.05；与模型组比较，◇P<0.05

讨 论

慢性浅表性胃炎，又称慢性非萎缩性胃炎，是一种由多种病因引起的胃黏膜的慢性浅表性炎症[6]，主要临床症状表现为上腹胀痛、灼热感、嗳气、反酸、食欲减退等。属于中医“胃脘痛”范畴[7]。其发病与多种因素有关，如幽门螺杆菌(HP)感染、免疫因素、辛辣刺激饮食、药物等，并且慢性浅表性胃炎发病时间长后极易发展成为慢性萎缩性胃炎[8]。西医主要采取根除幽门螺杆菌感染、保护胃黏膜、抑制胃酸分泌、促进胃肠动力等方法治疗。香砂六君子汤出自《古今名医方论》，由四君子汤加半夏、陈皮、木香、砂仁而成[9]，具有补气理胃，行气化滞之功，同时也是临床治疗脾胃虚弱，气机阻滞而变生胃痞的有效方剂[10]，属补益剂范畴。目前临床广泛用于消化性溃疡、漫性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎及功能性消化不良等[11]。方中党参补脾胃之气；白术健运脾胃以助消化；半夏与陈皮降气化痰；木香辛散温通，化滞助运；砂仁理气和胃止呕[12]。

如果从现代医学角度来进行分析，胃肠道中消化液的分泌，小肠对各类营养物质的吸收及胃肠平滑肌的自身运动均需要耗费能量，而这些所需能量则主要是由线粒体对食物的氧化提供。人体全身的组织细胞当中几乎都存在着线粒体，线粒体是生物体内细胞对食物进行生物氧化作用，进而不断产生能量的重要细胞器，因此它又被称为“ATP的生产基地”、或是“细胞的动力站”。它在人体能量代谢系统中占有重要地位[13],这与中医脾为“气血生化之源”、“后天之本”的说法密切相关[14]。琥珀酸脱氢酶是线粒体的一种标志酶，位于线粒体内膜上的一种与内膜相结合的酶，是连接呼吸电子之间传递和进行氧化磷酸化的枢纽之一。除此之外，它还可以为多种原核细胞产生能量的呼吸链提供电子。由此我们可以说，SDH的活性增高也就代表着细胞内的能量即ATP生成也随之增强[15]。细胞色素氧化酶，也被叫做呼吸链复合物，它位于呼吸链的末端，起到催化细胞色素氧化的作用，同时驱动其合成，也是线粒体的标志酶，其酶活性的发挥对于维持各个部位线粒体结构和功能以及细胞能量的产生有非常重要的意义和作用。脾主运化的功能正常，则可以从饮食水谷中摄取精微以营养五脏六腑、四肢百骸，而各类营养物质的吸收，就是一个主动消耗能量、不断消耗ATP的过程。由此可以得出的结论是，脾主运化功能的强弱与琥珀酸脱氢酶的活性与细胞色素氧化酶C的含量密切相关。

实验开始时，各组小鼠的体质量并无明显差异，粪便质地、数量均正常。除正常组(健康组)外，其余各组小鼠于造模第8天开始就逐渐出现饮食量下降，毛发不光泽且稀疏，大便稀软粘腻，肛周不洁，活动频率下降等表现。说明慢性浅表性胃炎在一定程度上可以引起身体消瘦，食欲不振的症状。本实验结果显示，香砂六君子汤可以显著提高脾气虚证浅表性胃炎大鼠胃窦组织琥珀酸脱氢酶的活性及细胞色素氧化酶C的含量，从而增强胃窦细胞线粒体的氧化供能作用，说明香砂六君子汤作为益气和胃，行气化滞之良方，具有较好的治疗浅表性胃炎的作用，其作用机制可能是通过提高胃窦细胞线粒体细胞色素氧化酶的含量及琥珀酸脱氢酶的活性实现的。