马铃薯细菌多样性解析及促生高产IAA菌株的筛选

崔伟国，尹彦舒，张方博，崔 曼，杨 茉，张树清，郑红丽*，高 淼*

（1．内蒙古农业大学农学院，内蒙古 呼和浩特 010010；2．中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/农业农村部农业微生物资源收集与保藏重点实验室，北京 100081）

马铃薯是继小麦、水稻和玉米之后的世界第四大粮食作物［1］。马铃薯种植户为了追求更高的产量和效益，种植中大量使用化肥，导致土壤板结、肥料利用率降低、环境污染等诸多问题。用微生物肥料替代化学肥料，既可以促进作物生长、改善土壤，又可以减少环境污染［2-3］。植物促生菌对植物的促生作用是通过多种机制和途径实现的［4］。研究发现，某些微生物可以产生植物生长激素吲哚乙酸（IAA）［5］，IAA参与了许多生理生化过程的调节与控制，具有广泛的生理作用，IAA可以促进细胞分裂、叶片增大、茎伸长、不定根的形成、种子的生长、果实的生长、座果和顶端优势等［6］，对于促进植物生长具有重要作用；某些微生物会产生1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶，它可以降解乙烯的合成前体ACC，并减少逆境条件下乙烯的产生量［7］；还具有溶磷的能力，能够将土壤中难以吸收利用的磷转化为植物可吸收利用的状态［8］。植物根系周围存在着数以万计的IAA产生菌，包括Pseudomonas，Rhizobium，Azospirillum，Enterobacter，Azotobacter，Klebsiella，Alcaligenes，Pantoea 和 Streptomyces［9］。林英等［10］从香樟根际土壤分离的产IAA菌株，经16S rDNA分子鉴定属于Bacillus，Pseudomonas和Lysinibacillus 3个属。王娇等［11］从七叶树的根茎中分离、筛选出的高产IAA的菌株，经鉴定属于Bacilluc，Leclercia，Pantoea和Morganella 4个属。本文从马铃薯根际土壤和叶片中用不同的培养基分离马铃薯优势细菌，分析马铃薯细菌的多样性；从中筛选高效分泌IAA菌株，研究其促生特性和对马铃薯幼苗促生能力，为马铃薯及其它植物研制微生物菌肥提供资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

马铃薯植株和根际土壤样品于2018年6月30日，采自河北省张家口市沽源县的马铃薯大田。

1.1.2 培养基与试剂

土壤浸提液培养基，R2A琼脂培养基［12］，阿须贝培养基［13］，DF培养基［14］，无机磷培养基和有机磷培养基［15］，牛肉膏蛋白胨培养基，配方详见上述参考文献。

ADF培养基：将1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）溶于超纯水，用细菌滤器进行抽滤灭菌，加到不含（NH4）2SO4的无菌DF培养基中，使ACC终浓度为3.0 mmol/L。

1.2 试验方法

1.2.1 马铃薯细菌的分离

称取10 g马铃薯根际土土壤样品，加入装有玻璃珠的90 mL无菌水中，180 r/min充分振荡0.5 h，即根际土母液菌悬液；马铃薯叶片内生菌的分离：从马铃薯植株取完整的叶片10 g，将叶片清洗干净后，采用超声波表面灭菌法进行表面灭菌，然后将叶片放入研钵充分研磨后加到带玻璃珠的90 mL的无菌水中，180 r/min充分振荡0.5 h，即叶片母液菌悬液。将上述菌悬液分别用无菌水稀释为10-1、10-2、10-3、10-4和10-5梯 度， 取10-3、10-4、10-53个连续的稀释度100 μL在已经制备好的固体培养基平板上进行涂布，每个梯度设置3个重复。同时以无菌蒸馏水作空白对照，所有平板放置于30℃的恒温培养箱培养3～5 d后，挑选颜色、形态不同的细菌单菌落进行平板划线，纯化以后转入甘油管进行保存，即分离到马铃薯根际土壤和叶片中的细菌。

1.2.2 细菌16S rDNA基因序列测定与系统发育分析

16S rDNA基因扩增、序列测定参考文献［16］，测序结果上传至http：//ezbiocloud.net/数据库进行比对。用MEGA7.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）软件，采用邻近法（Neighbor-Joining）聚类分析，并构建系统发育树，Bootstrap值为1 000。

1.2.3 产IAA能力测定

产IAA细菌的定性测定：将分离纯化后的细菌接种于含L-色氨酸（100 mg/L）的液体培养基中，30℃、180 r/min的摇床中黑暗震荡培养24 h后，取50 μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加入50 μL Salkowski比色液（50 mL 35% HClO4+1 mL 0.5 mol/L FeCl3）。并加入50 μL未接菌的液体培养基与等体积的混合溶液为对照。将充分混合的白色陶瓷板放置于室温避光处，30 min后观察结果，颜色变红者表示能够产 IAA［17］。

产IAA细菌的定量测定：对初筛获得的产IAA的细菌进行定量测定，培养条件同上。每株菌3个重复，先测定培养了24 h的菌悬液的OD600值，计算菌体的生长，然后将菌悬液以10 000 r/min离心10 min后，取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置30 min，取出立即测定其OD530值，以加了比色液的CK调零，计算IAA的产量。计算菌浓度OD600值为1时，单位体积发酵液中IAA的含量。标准曲线的绘制采用分析纯的IAA梯度稀释制备。

1.2.4 产ACC脱氨酶能力测定

参考Glick的方法［18］，将分离到的产IAA的菌株先接种于ADF培养基中，以空白ADF培养基作为阴性对照，初步筛选ACC脱氨酶阳性菌株。菌体蛋白含量测定采用比色法，测定595 nm处的吸光度值；以α-酮丁酸为底物，用紫外分光光度计调零，测定540 nm处的吸光度值，对照α-酮丁酸标准曲线和牛血清白蛋白测定标准曲线计算菌株的ACC脱氨酶活性。ACC脱氨酶表示方法为：反应条件下，每毫克菌体蛋白每小时催化ACC脱氨形成α-酮丁酸的微摩尔数，单位：μ mol/（mg蛋白质·h）。

1.2.5 溶磷能力测定

将马铃薯产IAA菌株用移液枪吸取3 μ L于无机磷和有机磷培养基平板上［19］，每个菌株设置3个重复，将平板置于30℃培养箱培养一周后观察，菌株周围是否有溶磷圈的形成及其直径大小，以此来判断该菌株有无溶磷能力。

1.2.6 产IAA细菌对马铃薯幼苗促生效果研究

促生试验：第一轮处理接种产IAA的7株菌， 分 别 是MLS-34-25、MLS-34-46、MLS-34-71、MLS-34-77、MLS-34-79、MLS-35-3、MLS-35-18，每个处理设置3个重复；对照组，不接菌。第二轮处理接种2株菌，分别是MLS-34-25和MLS-34-79，每个处理设置3个重复；对照组，不接菌。将菌株接于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃、180 r/min培养3 d，使发酵液浓度为1.0×109～9.0×109cfu/mL，保存备用。

将种植马铃薯的土壤进行高温灭菌，按照土壤、蛭石体积比2∶1进行混合，装盆待用。

马铃薯出芽以后，切取大小一致的带芽的马铃薯薯块进行播种。每盆种植一颗马铃薯种子。当马铃薯出苗两周以后，挑取长势一致的幼苗，以灌根法每盆分别接种上述菌液100 mL，对照组加100 mL清水。30 d后，观察马铃薯的生长情况，测定其株高，地上部分鲜重和干重，分析不同产IAA的菌株对马铃薯生长的影响。

1.2.7 数据处理

单因素方差分析采用SPSS 20.0对数据进行方差齐性检验（F＜0.05），其中P＜0.05代表存在显著性差异。多组样本间差异显著性分析在SPSS里采用Duncan’s multiple range test对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 马铃薯细菌的分离及16S rDNA的鉴定

本文采用不同的培养基从河北省张家口市沽源县的马铃薯根际土壤和叶片中共分离到马铃薯优势细菌78株。分别以78株细菌的总DNA为模板，采用16S rDNA基因通用引物27F和1492R，PCR扩增到16S rDNA基因大小约1.5 kb，菌株全部测序成功。序列结果经http：//ezbiocloud.net/数据库进行比对，基于最高相似度菌株结果显示：78株马铃薯细菌属于19个属（表1）。优势菌属是Pantoea，占菌株总数的55.13%。马铃薯根际土用土壤浸提液培养基分离出1株优势细菌，占菌株总数的1.28%，属于Pseudarthrobacter 1个菌属；马铃薯根际土用R2A琼脂培养基分离出27株优势细菌，占菌株总数的34.62%，属于Pantoea，Stenotrophomonas，Lysobacter，Arthrobacter，Bacillus，Klebsiella，Pseudomonas，Brevibacterium，Chitinophaga，Microbacterium，Myroides，Rhodococcus，Sphingopyxis 13个菌属；马铃薯根际土用阿须贝培养基分离出31株优势细菌，占菌株总数的39.74%，属于 Pantoea，Pseudomonas，Ensifer，Mesorhizobium，Stenotrophomonas，Chitinophaga，Sphingobacterium，Agromyces，Variovora 9个菌属；马铃薯叶片内生菌用阿须贝培养基分离出19株优势菌，占菌株总数24.36%，属于Pantoea，Bacillus，Pseudomonas 3个菌属。采用邻近法，将78株马铃薯细菌及其最高相似度菌株16S rDNA基因序列进行系统发育分析（图 1）。

图1 马铃薯产IAA菌及其最高相似度菌株16S rDNA基因序列基于邻近法的系统进化发育树

表1 马铃薯78株细菌的分类信息表

2.2 马铃薯细菌产IAA能力研究

以分离获得的78株马铃薯细菌为供试菌株，采用Salkowski比色液显色法定量测定菌株产IAA能力。结果显示：78株马铃薯细菌中，有58株细菌具有分泌IAA的能力，占菌株总数的74.36%，其中从马铃薯根际土筛选出42株产IAA细菌，属于Pantoea，Bacillus，Pseudomonas，Arthrobacter，Klebsiella，Sphingobacterium，Brevibacterium，Lysobacter，Mesorhizobium，Microbacterium，Pseudarthrobacter，Sphingopyxis，Stenotrophomonas 13个菌属；从马铃薯叶片筛选16株产IAA细菌，属于Pantoea，Bacillus 2个菌属。不同菌株产IAA的能力有很大的差异，供试菌株产IAA的分泌量在（0.80±0.07）～（40.27±5.73）μg/mL之间，菌株Pantoea sp. MLS-35-3分泌IAA能力最强，分泌量为（40.27±5.73）μ g/mL（表2）。根据菌株产IAA能力强弱和分离部位及分离培养基的差异，选择7株菌进行促生特性和马铃薯盆栽幼苗促生能力等研究，其中菌株Pantoea sp. MLS-34-25和菌株Pantoea sp.MLS-34-46由阿须贝培养基分离自马铃薯根际土壤，菌株Arthrobacter sp. MLS-34-71、Pantoea sp. MLS-34-77和Pantoea sp. MLS-34-79由R2A培养基分离自马铃薯根际土壤，菌株Pantoea sp. MLS-35-3和菌株Pantoea sp. MLS-35-18由阿须贝培养基分离自马铃薯叶片内生菌。

表2 马铃薯78株细菌产IAA能力

2.3 产ACC脱氨酶能力研究

通过对马铃薯7株产IAA细菌的筛选，结果显示有6株菌具有产ACC脱氨酶能力，其中菌株Pantoea sp. MLS-34-46的产量最高，达到了（2.648±0.057）μmol/（mg蛋白质·h）（表 3）。

表3 产IAA菌的功能特性

2.4 菌株的溶磷能力研究

经溶磷圈法检测，在7株产IAA细菌中，有1株细菌具有溶解无机磷的能力，为菌株Pantoea sp.MLS-34-77；有2株细菌具有溶解有机磷的能力，为菌株Pantoea sp. MLS-34-77和菌株Pantoea sp. MLS-34-79。其中菌株Pantoea sp. MLS-34-77既可以溶解无机磷，也可以溶解有机磷（表3，图2，图3）。

图2 产IAA菌株无机磷溶磷效果图

图3 产IAA菌株有机磷溶磷效果图

2.5 产IAA菌株对马铃薯幼苗的促生效果研究

第一轮产IAA菌株对马铃薯温室幼苗促生试验：以7株高效分泌IAA的马铃薯细菌为供试菌株，采用温室马铃薯盆栽实验，研究菌株对马铃薯幼苗的促生能力。从表4可以看出，与对照组相比，6株菌可以促进马铃薯幼苗株高的生长，其中菌株Pantoea sp. MLS-34-79和菌株Pantoea sp.MLS-35-18长势较好，与对照组相比达到了显著性水平，增长率分别为40.87%和47.83%；从地上部鲜重观察，7株菌处理以后的马铃薯植株都高于对照组，菌株Pantoea sp. MLS-35-3增产率最高，增加了65.37%，菌株Pantoea sp. MLS-34-25和菌株Arthrobacter sp. MLS-34-71增产率分别为49.15%和40.12%；7株菌处理以后的地上部干重均高于对照组，其中菌株Pantoea sp. MLS-35-3达到了显著性差异，增产率为94.51%，菌株Pantoea sp. MLS-34-25和菌株Pantoea sp. MLS-34-77增产率均为49.45%（表4，图4）。

从株高、地上部分鲜重和干重综合分析，选取菌株Pantoea sp. MLS-34-25和菌株Pantoea sp.MLS-34-79进行第二轮马铃薯幼苗的促生实验，以此来验证第一轮的促生试验结果，以期望获得具有稳定促进马铃薯植株生长的菌株。结果显示，菌株Pantoea sp. MLS-34-25和菌株Pantoea sp. MLS-34-79均能够显著增加马铃薯植株的株高和地上部鲜重，菌株Pantoea sp. MLS-34-25表现出了较好的促生效果，株高增长率达到了71.50%，地上部鲜重增产率达到了86.38%，地上部干重增产率为41.89%。与对照相比，菌株Pantoea sp. MLS-34-25处理过后的植株长势较好，叶片茂绿（表4，图 5）。

表4 产IAA菌株对马铃薯盆栽幼苗促生试验结果

图4 产IAA菌株对马铃薯盆栽幼苗促生试验效果图（第一轮）

图5 产IAA菌株对马铃薯盆栽幼苗促生试验效果图（第二轮）

3 讨论与结论

绝大多数已被研究的高产IAA菌株主要属于Pseudomonas、Bacillus、Azotobacter、Azospirrulam和Rhizobia菌属［20］。随着研究的深入，属于不同菌属的高产IAA菌株被报道。刘晓瑞［21］从水稻根际分离的95株细菌中，通过Salkowski试剂检测IAA活性、水稻种子萌发和幼苗促生试验等相关研究，筛选获得6株产IAA菌，分别属于Bacillus、Agrobacterium、Pseudomonas和Aeromonas。本研究从马铃薯根际土和叶片中共筛选出58株产IAA细菌，优势菌属是Pantoea；其中从马铃薯根际土筛选出Pantoea、Bacillus、Pseudomonas等13个菌属；从马铃薯叶片筛选出Pantoea、Bacillus 2个菌属。在已知报道的产IAA菌株当中，不同菌株的IAA分泌水平有很大差异。例如，刘琳等［22］从春兰获得57株分泌IAA内生细菌，其IAA分泌量为0.5～129.68 μg/mL。胡泽瑞等［23］从三叶鬼针草分离的7株产IAA菌中，其分泌量为57.48～312.22 μg/mL。本研究分离到的产IAA菌株分泌量为0.80～40.27 μ g/mL之间，低于其他文献报道菌株。微生物促进植物生长的机制有多种，一种促生微生物可以兼具多种促生机制［24-25］。研究发现，ACC脱氨酶能够降低植物对逆境的敏感性，提高植物抗逆能力［24］，而且可以促进有机物污染和重金属污染土壤的植物修复［26］。Sarkar等［7］分离出一株耐盐的ACC脱氨酶菌株P50，该菌株在盐胁迫下促进了水稻幼苗的生长。本研究中的7株高产IAA马铃薯细菌中有6株具有产ACC脱氨酶能力，其中Pantoea sp. MLS-34-46的产量最高，达到了（2.648±0.057）μ mol/（mg蛋白质·h）。磷是植物生长发育所需的重要元素之一，解磷微生物可以将难溶性磷源转化成植物可吸收利用的磷［27］。本研究筛选到1株菌具有溶解无机磷的能力，2株菌具有溶解有机磷的能力。植物根际产IAA菌能够分泌IAA促进生长，提高作物产量。例如，张东艳等［28］将产IAA菌株接种花生30 d以后，花生植株鲜重、干重及株高较对照处理分别增加76.2%、23.0%和23.0%。孟丽媛等［29］研究发现，产IAA菌株对水稻幼苗初生根数、次生根数和茎干重的增长有明显的促进效果。本研究通过两轮温室盆栽实验，研究高产IAA菌株对马铃薯幼苗的促生效果，结果显示，菌株Pantoea sp. MLS-34-25对马铃薯幼苗的株高、地上部鲜重和干重均具有明显的促生效果，且兼具有较高的ACC脱氨酶活性（1.265±0.029）μ mol/（mg蛋白质·h）。菌株Pantoea sp. MLS-34-25对马铃薯幼苗具有明显的促生作用，是生产微生物肥料的潜在菌种。