枯草芽孢杆菌液体发酵条件优化探究

徐亚英 黄晓梅 谢丽

摘 要 通过单因素试验对枯草芽孢杆菌液体发酵培养基及发酵条件进行了优化，为实现该菌株的工业化生产提供数据参考。试验结果表明：该菌株培养基各组分的最佳配比为蛋白胨1%，麸皮∶酵母提取物（3∶2）为0.5%，氯化钠1%。最佳发酵培养条件为初始pH值6.0，培养温度为37 ℃，培养时间为24 h、装液量100 mL，接种量为4%，转速为200 rpm·min-1。

关键词 枯草芽孢杆菌;发酵条件;单因子试验

中图分类号：S432.2+2 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.20.071

农田中许多病害严重发生，化学防治使病原菌的抗药性增强、不断分化出新的生理小种，同时造成药物残留，对食品安全造成隐患，破坏环境。目前，从微生物代谢物中筛选出防治有害生物的生防农药成为新农药研究的重要方向。生物农药具有高效低毒的优点，越来越受到人类的青睐。

迄今为止，具有生物防治功能的细菌有100多种，我国和世界上许多国家已有商品化微生物农药产品。但是，多数菌剂在田间应用过程中防效不稳，制约微生物菌剂开发应用。此外，多数研究只是针对某一种病害，具有广谱抗性的菌株很少。

芽孢杆菌是我国农业部正式批准使用的益生菌，对抗生素无耐药性，对人畜无毒无害，绿色环保，对环境无污染，对作物安全，可产生多种抗生素，包括脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类等物质，对多种动、植物与人类病原菌具有较好的抑制作用。而且该菌还具有很强的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶活性，并具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。

枯草芽孢杆菌作为有益的根际微生物，越来越得到人们的重视，目前在辣椒、玉米、黄瓜、水稻等农作物的病害上具有较好的生防效果。其芽孢可以制成粉剂、添加剂等各种制剂应用于工农业等各个方面。但是在目前的工业化生产中，常用的发酵方法中存在周期长、芽孢数含量低、成本高等诸多问题。因此，作为微生物制剂，枯草芽孢杆菌发酵工艺的研究对其应用具有非常重要的意义。本试验通过单因素筛选对该菌株的发酵工艺与条件进行优化，为该菌株生防菌肥的工业化生产提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌由黑龙江农业职业技术学院分析检测中心微生物实验室筛选保存。

1.1.2 培养基

种子培养基与基础发酵培养基均为LB，即蛋白胨10 g·L-1，酵母浸出物5 g·L-1，氯化钠10 g·L-1，自然pH。

1.1.3 试剂

蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖、胰蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏、硫酸镁、氯化铵、硫酸铵、磷酸二氢钾、氯化钠和氯化钙等，均为分析纯试剂。

1.1.4 仪器设备

摇床、天平、高压蒸气灭菌锅、无菌操作台、pH计及紫外-可见分光光度计等。

1.2 方法

1.2.1 培养的方法

1.2.1.1菌种的活化

将已保存的菌种转接至LB固体培养基中，37 ℃静止培养24 h后待用。

1.2.1.2种子液制备

挑取活化的菌株单菌落于含50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，160 rpm·min-1，37 ℃摇床振荡16～18 h后待用。

1.2.1.3摇瓶的培养

分别取一定量的种子液，按2%的比例接入含30 mL发酵培养基的三角瓶中，然后置于37 ℃的摇床中，振荡培养24 h，转速为200 rpm·min-1，以进行单因素发酵条件研究。

1.2.2 培养基配方的单因素筛选试验

1.2.2.1碳源

分别用5 g·L-1的葡萄糖、酵母粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、麸皮、麸皮∶酵母粉（1∶4）、麸皮∶酵母粉（2∶3）、麸皮∶酵母粉（3∶2）、麸皮∶酵母粉（4∶1）替换基础培养基的碳源。利用摇瓶发酵的培养条件，24 h后测定发酵液的活菌数，以确定最佳的碳源。

1.2.2.2氮源

分别用10 g·L-1的蛋白胨、硫酸铵、牛肉膏、尿素、硝酸铵、氯化铵、豆粉代替基础发酵培养基的氮源。利用摇瓶发酵的培养条件，24 h后测定发酵液的活菌数，以确定最佳的氮源。

1.2.2.3无机盐

分别以5 g·L-1麸皮∶酵母粉（3∶2）和10 g·L-1蛋白胨为碳源和氮源，在此基础上分别加入10 g·L-1的NaCl、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、KCl替代等

量的基础发酵液的无机盐。采用摇瓶发酵的培养条件，24 h后测定发酵液的活菌数以确定最佳的無机盐。

每个处理三次重复，其他发酵条件与测定方法同“1.2.1.3”。

1.2.3 发酵条件的筛选

利用筛选出的最适培养基配方，固定摇瓶培养的其他发酵条件，分别对初始pH、装液量、温度、接种量、发酵时间与转速进行优化，如表1所示。

以上试验均设置3次重复。

1.2.4 测定方法

菌体生长曲线的测定采用OD600 nm值（下同）比浊法。取发酵液10～15 mL在2 000 rpm·min-1下离心2 min，测定菌液的OD600 nm值;pH测定仪测定菌液pH。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基优化

2.1.1 碳源

用不同碳源进行筛选试验，其他组分都相同进行发酵。用比浊法测定其发酵液的OD600 nm值可知，酵母提取物作为碳源时枯草芽孢杆菌的生长明显优于其他碳源，其次是麸皮，如图1所示。

考虑到以后工业发酵的成本，本研究又将麸皮与酵母提取物按1∶4、2∶3、3∶2、4∶1的比例分别作为碳源进行试验，结果表明，麸皮与酵母提取物按不同比例混合作为碳源时仍能满足生产需要，如图2所示。麸皮∶酵母粉（3∶2）为枯草芽孢杆菌生长的最佳碳源。

2.1.2 氮源

选用7种不同的氮源培养基，从试验结果可以看出，以蛋白胨为唯一氮源时该菌的生长能力最强，其发酵菌液OD600 nm值最高，其次是牛肉膏，如图3所示，说明枯草芽孢杆菌生长的最适氮源是蛋白胨。

2.1.3 无机盐

2.2 发酵条件实验

2.2.1 初始pH

将初始pH分别调至不同的pH值，在摇瓶发酵培养条件下培养24 h。如图5所示，初始pH值为6.0时发酵液的OD600 nm值最大，当发酵液的初始pH>6.0时，发酵液OD600 nm值开始逐渐下降。所以，枯草芽孢杆菌液体发酵的最适初始pH值为6.0左右。

2.2.2 接种量

对不同接种量进行筛选，在摇瓶发酵培养条件下培养24 h，设初始pH值为6.0。通过实验可知，枯草芽孢杆菌培养的最适接种量为4%，在接种量为1%～4%时，随接种量增加，发酵液的OD600 nm值略有升高。接种量大于4%时，枯草芽孢杆菌发酵液OD600 nm值开始下降

2.2.3 装液量

在摇瓶发酵的培养条件下培养24 h，设初始pH值为6.0，接种量为4%。由图7可知，通过对发酵液OD600 nm值的测定，采用100 mL装液量时发酵液OD600 nm值最大，随后随装液量的增大，发酵液OD600 nm值呈下降趋势。

2.2.4 时间

在上述筛选出的最佳发酵条件的基础上，分别对不同的发酵时间进行筛选。通过试验可知，随着摇菌时间的增加，其OD600 nm值也增加，在24 h时，其OD600 nm值达到最大，随着摇菌时间的延长，自24 h后菌液含菌数开始逐渐减少，OD600 nm值缓慢变小，枯草芽孢杆菌进入生长衰亡期，如图8所示。所以，最佳的摇菌时间为24 h。

2.2.5 温度

在摇瓶发酵培养条件下培养24 h，测定发酵液的OD600 nm值。由图9可知，高温与低温都对菌体生长不利。当发酵温度是37 ℃时，其菌体生长量达到最高。温度高于或低于37 ℃，含菌数都有所下降。因此，该菌株的最适发酵温度是37 ℃。

2.2.6 转速

如图10所示，在转速100～250 rpm·min-1条件下培养，在200 rpm·min-1時OD600 nm值最大，枯草芽孢杆菌的生长量最大，因此确定枯草芽孢杆菌最适发酵转速为200 rpm·min-1。

3 结论

通过摇瓶单因素试验，确定了枯草芽孢杆菌的最佳碳源是5 g·L-1麸皮∶酵母粉（3∶2），最佳氮源是10 g·L-1蛋白胨，选用NaCl作为该菌株发酵培养基的无机盐。发酵最佳条件是发酵温度为37 ℃，初始pH值为是6.0，接种量为4%，转速为200 rpm·min-1。枯草芽孢杆菌发酵相关参数的研究为下一步其产业化发酵生产提供了良好的基础。

（责任编辑：刘昀）