龙血素B在模拟失重效应大鼠体内的分布研究

郭晶晶， 李玉娟， 陈博， 康丽婷， 王识博， 李勇枝，王佳平， 高建义

(1.北京理工大学 生命学院，北京 100081； 2.中国航天员科研训练中心，北京 100094 )

空间环境中存在失重、强辐射、噪声、昼夜节律混乱等不利因素[1-3]. 上述有害因素明显影响航天员骨骼、肌肉、心血管、内分泌和神经等系统的正常生理功能[4-5]. 许多国家都在寻找有效对抗措施、积极开发防治药物，以保护航天员的身心健康[6-8].

近年来，以整体综合调节为特色的传统中药在中国载人航天医学领域中表现出了巨大的应用潜力，如用于改善空间环境下机体心血管功能的太空养心方[9]，以及用于防治骨质疏松的强骨抗痿方等[10]. 龙血竭为传统名贵傣药，是百合科龙血树属剑叶龙血树Dracaena cochinchinensis (Lour.) S. C. Chen分泌的树脂[11]，其具有活血化瘀[12-13]、定痛止血[14]等药理作用. 本课题组前期研究发现龙血竭对空间辐射以及模拟失重效应造成的心血管和神经系统损伤等有显著保护作用[15-18]. 龙血竭富含黄酮类、甾体、萜类等活性成分[19-20]，其中龙血素B (Loureirin B, LB)属二氢查尔酮类化合物，常用作龙血竭的质量控制指标，具有良好的活血化瘀[21]、镇痛[22]等作用.

失重造成的体液头向转移、体液容量及体液循环变化可能改变药物在机体内的动态过程(吸收、分布、代谢和排泄)，影响药物进入体循环的总量、血药浓度和半衰期等，进而影响药物的有效性和安全性. 迄今失重环境下的药物分布研究较为少见，本研究建立大鼠尾悬吊模型，比较龙血素B在正常重力与模拟失重效应大鼠体内的组织分布差异，探讨模拟失重效应对药物分布的潜在影响，有望为龙血竭在载人航天中的应用提供基础数据支持.

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级雄性SD大鼠12只(体重200±20 g)，由中国食品药品检定研究院实验动物资源中心提供，许可证号SCXK-(京)2009-0017，饲养环境温度20～25 ℃，湿度50%～60%，自由饮水摄食，实验前适应性饲养1 w.

1.2 实验仪器

ME204E型电子天平(瑞士Mettler公司)、Eppendorf Centrifuge 5417R型离心机(德国Eppendorf公司)、ULTra-80 ℃型低温冰箱(美国Thermo科技公司)、1290型超高效液相色谱仪(美国Agilent公司)、6460型三重四级杆质谱仪(美国Agilent公司)、WH-3微型旋涡混合仪(上海沪西仪器厂).

1.3 实验试剂

LB、大黄酸 (内标, internal standard, IS)对照品，化学结构见图1，购于中国食品药品检定研究院. 甲基叔丁基醚 (MTBE)、甲醇、乙腈为色谱纯，购于美国Fisher公司. 其余试剂均为分析纯.

2 方 法

2.1 模型建立与样本收集

大鼠适应性饲养1 w后随机分为2组，每组6只：分为正常重力组(normal gravity group, NG)和模拟失重效应组 (simulated microgravity group, SMG). NG大鼠饲养于普通鼠笼中，SMG大鼠采用Morey-Holton尾悬吊方法建立模拟失重效应模型：将大鼠置于吊尾笼，尾部悬吊于笼顶，前肢踏于笼底，使大鼠头低位，躯干与鼠笼的水平面呈30°，后肢自由悬空不负重，大鼠可在笼内自由活动，饮水摄食[23]. 动物饲养与实验均遵照北京理工大学实验动物饲养和使用规定进行. 大鼠饲养21 d后，禁食12 h，自由饮水，然后以25 mg/kg剂量灌胃LB，1 h后麻醉、心脏灌流并处死，取肝、肠、脑、心、脾、肾、肺、胃、睾丸和骨骼肌10种脏器组织用生理盐水洗净，滤纸吸干，置于-80 ℃冰箱中避光保存待测.

2.2 对照品储备液、工作曲线及质控样本制备

精密称取适量LB、IS对照品，分别用色谱甲醇溶解定容制得1.0 mg/mL的储备液. 再用甲醇稀释成7.81～1 000.00 ng/mL的LB系列对照品溶液、1 μg/mL的IS对照品溶液，置于4 ℃冰箱避光存放. 取空白肝脏等组织适量，加入2倍体积预冷的生理盐水在玻璃匀浆器中制成匀浆，10 kg离心10 min，取上清得空白基质. 取空白基质50 μL加入LB溶液50 μL，制成终浓度依次为7.81，15.62，31.25，62.50，125.00，250.00，500.00，1 000.00 ng/mL的工作曲线系列溶液. 取各空白组织基质(肝、肠等)分别加入LB溶液50 μL，制成终浓度为7.81，125.00和800.00 ng/mL的低、中、高浓度质量控制(quality control, QC) 样本.

2.3 样本预处理

取肝、肠等待测组织适量，加入2倍体积预冷的生理盐水在玻璃匀浆器中制成匀浆，10 kg离心10 min. 取上清50 μL，依次加甲醇50 μL和IS溶液10 μL，涡旋混合10 s，再加入MTBE 400 μL后室温充分振荡5 min，10 kg离心10 min. 取有机层于40 ℃氮气流下吹干，加入甲醇100 μL复溶，5 kg离心2 min，取上清待分析.

2.4 色谱与质谱条件

色谱分离方法参考文献[24]并加以改进，色谱柱采用Agilent Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×50 mm, 5 μm填料)，柱温为室温. 流动相为A：水(含5 mmol/L甲酸铵)，B：乙腈. 流速设置为0.2 mL/min，进样量10 μL，采取梯度洗脱，洗脱程序：0 min 10 % B，0～0.5 min 10 % B，0.5～1.5 min 10 % ～90 % B，1.5～2.5 min 90 % B，2.5～3.5 min 90 % ～ 10 % B，3.5～5min 10 % B，5 min 停止.

质谱仪采用电喷雾离子源，负离子检测模式. 质谱参数参考前期研究设置[24]：离子源喷射电压3 500 V；干燥气温度250 ℃；碰撞气、鞘气、辅助气为氮气；雾化器、加热器、干燥器压力分别为60，55，20 psi；毛细管出口电压LB 142 V、IS 89 V；碰撞能量LB 39 eV、IS 15 eV；多反应检测离子对为LB 315.1→92.0、IS 255.1→240.1.

2.5 方法学验证

根据美国FDA生物样品分析方法指南，对上述分析方法的专属性、标准曲线、准确度与精密度、回收率和稳定性进行考察和确证[25].

专属性：将10种组织空白基质、添加LB和IS的空白基质、各实际组织样本进样分析，得到各自色谱图，用以考察LB和IS的分离度及内源性物质是否干扰LB和IS的测定.

标准曲线：以LB和IS的峰面积比值为纵坐标，LB浓度为横坐标，进行加权最小二乘法回归运算，求得回归方程和相关系数.

准确度与精密度：取各基质不同浓度QC样本进行分析，以当日的标准工作曲线计算LB浓度，重复3次得到日内精密度和准确度；连续测定3 d，计算方法的日间精密度和准确度. 准确度用相对误差(RE)表示，精密度用相对标准偏差(RSD)表示.

回收率与稳定性：取各基质QC样本，测LB色谱峰面积，与相同浓度的LB对照品溶液峰面积进行比较，计算方法的回收率. 取各浓度的QC样本，测定LB浓度，然后分别置于室温24 h、3次冻融循环 (-20 ℃) 和低温保存 (-80 ℃)一个月的环境中，再次测定LB浓度，计算2次结果的相对误差(RE)，以考察方法的稳定性.

2.6 统计学分析

实验数据采用SPSS 17.0软件(美国IBM公司)进行统计处理，结果以均值±标准差表示，组间差异采用独立样本t检验分析，p<0.05认为差异有统计学意义.

3 结果与讨论

3.1 方法学确证

3.1.1专属性

分别取各空白组织基质、添加LB和IS的各空白组织基质、待测的实际样本进行HPLC-MS/MS分析，得到各自色谱图. 结果显示LB和IS的保留时间约为2.61和2.68 min，组织内源性物质不干扰LB和IS的测定. 图2列出空白肝组织、添加LB和IS的空白肝组织、大鼠给药1 h后肝组织样本的代表性色谱图.

3.1.2标准曲线

如表1所示，各基质中LB在7.81～1 000.00 ng/mL范围内呈良好线性相关，相关系数r2均大于0.996.

表1 各基质中LB线性范围、回归方程及相关系数

Tab.1 Calibration range, regress equation and correlation coefficient in biological matrices

生物样本线性范围/ (ng·mL-1)回归方程相关系数r2肝7.81 ～1 000.00y=383.1x-21.110.996 0脑7.81 ～1 000.00y=389.2x-10.490.999 7肠7.81 ～1 000.00y=384.8x-8.7770.999 5心7.81～1 000.00y=265.0x-14.630.998 0肾7.81 ～1 000.00y=332.6x+1.7370.998 0胃7.81～1 000.00y=329.3x-3.0940.999 6肺7.81 ～1 000.00y=349.4x-11.670.999 7睾丸7.81～1 000.00y=378.7x+0.6260.998 1骨骼肌7.81 ～1 000.00y=318.4x-2.4670.999 1脾7.81～ 1 000.00y=437.1x-12.470.999 8

3.1.3准确度与精密度

各基质中LB日内与日间准确度RE均在±10%以内，精密度RSD均小于15.0 %，表明该方法准确、可靠、重现性好，符合生物样品分析方法指导原则的要求[25].

3.1.4回收率与稳定性

LB在各基质中的萃取回收率均大于90%，在室温放置24 h、-20 ℃ 3次冻融循环和- 80 ℃保存一个月后的相对误差RE均在±8%以内，符合生物样品分析方法指南的规定[25]. 结果表明，样本在以上储存条件下稳定，分析结果可靠.

3.2 LB的组织分布

按2.1和2.2节的实验操作处理实际样本后，进行HPLC-MS/MS分析. 如图3所示，LB在NG组大鼠肝、胃组织中的质量分数分别为4.3±0.9和3.3±0.7 μg/g，在大鼠肠、肾、心、脾、骨骼肌、睾丸、肺和脑组织中的质量分数分别为246.7±42.6，157.9±15.1，114.2±41.2，53.9±29.1，51.6±20.0，32.0±3.0，18.7±8.7，12.4±8.2 ng/g. 肝、胃中质量分数明显高于其他组织，然后依次是肠>肾>心>脾>骨骼肌>睾丸>肺>脑，脑中最少. LB在SMG组大鼠肝和胃中质量分数是6.3±0.6和3.4±0.5 μg/g，在肠、肾、心、脾、骨骼肌、睾丸、肺及脑组织中的质量分数为116.6±16.1，123.1±26.9，105.2±15.8，48.0±10.9，63.8±13.8，46.0±12.6，18.0±4.0，79.7±33.8 ng/g. 与NG组相比，LB在SMG组大鼠肝中质量分数升高47.7%(p<0.05)，在脑中质量分数上升了5.4倍(p<0.05)；在大鼠肠和肾中质量分数显著下降(p<0.05)，分别下降了52.7%及22.0%；在大鼠胃、心脏、肺、睾丸、骨骼肌中质量分数变化无显著性差异.

4 结 论

药物在体内的分布受到多种因素的影响，除了与药物自身的性质有关外，还与组织的血液循环、药物-组织的亲和力和机体生理状态等密切相关[26]. LB在各组织中的质量分数结果显示，LB在肝、胃的质量分数较高，肾、肠、心、脾、骨骼肌、肺次之，脑中最少，多集中分布于血流量丰富的组织，如肝、肾、肠等. LB在脑组织中的质量分数较低，或许是由于血脑屏障这一特殊结构的存在限制了LB向脑组织中转运，导致LB在脑中分布较少. 肝脏是血流量较丰富的器官，可能使LB在此处较多分布. 骨骼肌相比其他组织器官血管分布较少，可能导致LB在骨骼肌中分布较少.

与NG组相比，LB在SMG组大鼠肝中的分布明显增加. 肝血流量丰富，受血液循环的影响较大，在失重或模拟失重状态下，重力消失导致体液头向转移，肝中的血液量可能发生改变，使LB在肝中分布增多；同时课题组内研究发现模拟失重效应改变大鼠肝中部分药物代谢酶的表达或活性[27]，可能使LB在肝中的代谢减少，导致LB在模拟失重效应大鼠肝中质量分数上升. 上述2种可能也许是LB在模拟失重效应大鼠肝中分布增多的原因. SMG组大鼠脑中LB质量分数升高，或许与血脑屏障结构改变有关. 本课题组研究发现模拟失重效应下大鼠血脑屏障的通透性增加，血脑屏障上部分外排蛋白(如：P-糖蛋白)表达或功能发生改变[28]，有可能导致LB在脑中分布增多，但具体机制仍待进一步研究. LB在SMG组大鼠肠中的分布显著减少. 据相关文献报道，失重模型下大鼠肠系膜小静脉网的血流阻力减少[29]，下半身/后半身动脉萎缩[30]等，均有可能造成肠道的血流量或血流速度改变，导致肠中的LB量下降. 另课题组内研究发现，模拟失重效应大鼠肠道药物代谢酶或药物转运外排蛋白(如：P-糖蛋白)的表达和活性发生变化，也有可能是改变LB在肠中分布的原因.

本课题组曾对LB在模拟微重力效应大鼠体内的药物动力学进行了研究，结果显示：与NG组相比，LB在SMG组大鼠体内的药时曲线下面积AUC0-t、达峰浓度Cmax和生物利用度F皆降低，说明LB进入机体血液循环的总量减少[24,31]. 但LB在SMG组大鼠肝中分布较NG组增多，这种现象或许与SMG组大鼠肝中代谢LB的代谢酶表达量或活性变化有关[32]. 目前常见LB在血瘀血栓和疼痛模型中发挥较好的活血化瘀和镇痛作用报道[21-22]，尚无在模拟微重力效应大鼠体内的药效研究. 课题组前期研究表明龙血竭对模拟微重力效应导致的中枢神经系统损伤有明显的保护作用[32]，推测可能与龙血竭有效成分LB在SMG组大鼠脑中分布增加相关. LB在SMG大鼠体内的药动学、生物利用度、药效与组织分布的关系还需深入研究.

本文首次对LB在正常重力和长期模拟失重效应大鼠体内的组织分布进行了研究，发现LB的分布具有组织特异性，且模拟失重效应会显著影响LB在大鼠体内的分布过程. 该结果为失重条件下的药物分布研究提供基础数据，而失重条件下的药物分布机制有待进一步研究.