酸碱对大豆油脂中反式脂肪酸的影响

于殿宇 唐洪琳 周 琪 刘竞阳 徐 博 王 利 罗淑年 秦兰霞* 王立琦

（1 东北农业大学食品学院 哈尔滨150030 2 哈尔滨商业大学计算机与信息工程学院 哈尔滨150028 3 黑龙江省完达山乳业股份有限公司 哈尔滨150020 4 九三集团哈尔滨惠康食品有限公司 哈尔滨150010）

大豆油原料丰富，营养价值高，是我国消费量最多的油脂，它含有丰富的不饱和脂肪等必需脂肪酸，有益于人体健康，其中亚油酸的含量为50%以上[1-3]。然而，在油脂精炼过程中，毛油要经受高温、酸碱和金属设备，油脂的化学组成会发生变化，也会形成一定量的反式脂肪酸 （Trans fatty acid，TFA）[4-7]。研究证实长期摄入TFA 容易引发动脉粥样硬化、血栓、冠心病和心脏病等心血管疾病，TFA 的摄入量每增加2%，患心血管疾病的危险性就增加25%[8-11]。此外，油脂在深度加热或煎炸的过程中也会产生氢过氧化物及醛、酮、反式脂肪酸等物质，造成油脂氧化酸败，影响食品风味及正常食用，甚至危害人体健康[12-15]。苏德森等[16]研究了5 种食用油在加热过程中TFA 的形成和变化。结果表明：加热温度、加热时间和食用油中脂肪酸组成均是影响反式脂肪酸形成和变化的因素，并且随着加热温度的升高或加热时间的延长，食用油中反式脂肪酸种类和含量都不断增加。李安等[17]研究比较了大豆油加热过程中的TFA 与酸价、羰基价和极性组分等理化指标的变化情况。研究发现随着加热时间的延长，油脂的品质逐渐下降，酸价、羰基价和极性组分3 种指标含量极显著增加。姚世勇等[18]对加热的花椒籽仁油中的研究结果证实，反式脂肪酸生成的多少与加热的油脂和时间呈正相关关系。

C=C 双键在异构化旋转之前，双键会受极端条件的影响而遭到明显破坏。这样就会直接打破π 键，跨越异构化旋转所需要的能量势垒。随着π键的断裂，脂肪酸的反式异构化更容易形成。Karabulut 等[19]研究发现在油氢化过程中被金属（如镍）和自由基（如硫代自由基）催化会导致C=C双键的异构化；蒲敏等[20]采用量子化学中的密度泛函理论计算方法，在B3LYP/6-31G** 和B3LYP/6-311++G** 基组水平上研究羟基丙烯醛的双键旋转异构反应机理，发现该异构化反应存在两个过渡态和一个重排四元环骨架的中间体；Tsuzuki等[21]在研究油酸甘油三酯的热致异构化时，计算异构化反应所需的能量约为106 kJ/mol。Li 等[22]对加热过程中油脂中的非共轭亚油酸的热致异构化进行研究，从量子化学的角度上揭示加热油脂中非共轭亚油酸的分子结构变化及能量途径。温度是导致不饱和脂肪酸热异构化的关键因素。顺、反式脂肪酸分子本身的热稳定性与异构化反应发生的可能性明显相关。目前对于强酸或强碱处理后的加热油脂中双键引起的热诱导异构化的机理鲜有报道。

本研究以大豆毛油为原料，在大豆毛油中加入85%的H3PO4（或18 Be°NaOH）溶液，添加量为0.3%，反应一定时间后水洗，得到H3PO4处理后的油脂样品或NaOH 处理后的油脂样品。以大豆毛油常规加热为对照，研究了H3PO4处理的油脂样品或NaOH 处理的油脂样品在不同加热温度、时间的条件下大豆油中反式亚油酸含量的变化，并对其损耗途径及其转化产物进行能垒分析，从分子角度能量入手研究异构化反应途径，从分子本质上揭示异构化反应机理，为寻找强酸或强碱处理后油脂热致异构化形成TFA 的控制措施提供了可能性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脂肪酸标样，美国西格玛奥德里奇公司；大豆毛油（C18∶2-9t，12c∶0%；C18∶2-9c，12t∶0%；C18∶2-9t，12t∶0%），九三粮油工业集团有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

7890A 气相色谱仪，美国安捷伦公司；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市英峪高科仪器厂；LD4-2A 型低速台式离心机，北京京立离心机有限公司；VIC-612 型精密电子天平，德国Acculab 公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆油加热试验 称取100 g 的大豆毛油加入85%的磷酸（或18 Be°氢氧化钠）溶液，添加量为0.3%，搅拌10 min，静置。水洗后4 000 r/min离心分离去上清液。开始进行加热试验，取上述处理后的油样3 g 于5 mL 的安瓿瓶中，密闭封口（顶部留有空气）。其它油样的准备方法与上述方法相同。将安瓿瓶至于油浴锅中分别达到220，240，260 ℃时，开始计时，加热时间为2，4，6，8 h。新鲜大豆毛油作为对照样本与加热样本进行比较。每个温度与加热时间都进行3 次重复试验，温差控制在±2 ℃。

1.3.2 反式脂肪酸的分析 按照参考文献[23]的方法进行甲酯化。使用Aligent7890A 气相色谱仪，安捷伦公司CP-Sil-88 强极性毛细管气相色谱柱（100 m×0.25 nm×0.2 μm），氢火焰离子检测器（FID）。载气：N2，流量30 mL/min；燃气：H2，流量30 mL/min；助燃气：空气，流量380 mL/min；进样口温度260 ℃，检测温度260 ℃；柱前压281.7 kPa，柱温170 ℃，分流比100∶1，进样量1 μL。

1.4 数据分析

采用 Orgine 8.5 软件和SPASS 软件对数据进行处理和分析，键能的计算工作利用Gaussian09 软件完成，计算级别采用B3LYP/-311++g**。

2 结果与分析

2.1 强酸、强碱对加热大豆油脂产生反式亚油酸的影响

2.1.1 在220 ℃加热条件下大豆油脂产生的反式亚油酸 将H3PO4处理后的油脂样品，NaOH 处理后的油脂样品，未经处理的油脂样品，分别置于油浴锅中加热，研究3 种样品在220 ℃的条件下分别加热2，4，6，8 h 后3 种反式亚油酸的含量，其变化规律如图1所示。

由图可知，当大豆油脂加热时，经过酸或碱处理后的油脂，产生的反式脂肪酸要多于常规加热时产生的反式脂肪酸，当220 ℃加热2 h 时，NaOH处理后的油脂样品产生C18∶2-9c，12t 与C18∶2-9t，12c 分别为0.581%，0.587%，而产生的全反式脂肪酸仅为0.046%，可得C18∶2-9c，12t 和C18∶2-9t，12c 为加热大豆油脂反式亚油酸中的主要反式异构体[24]，并且单反式亚油酸含量显著高于全反式亚油酸含量，这可能与每步异构化反应能垒有关；随着加热时间的不断增加，加热油脂受酸碱影响的效果也会随之变大，其影响产生反式亚油酸的顺序为：NaOH 处理后油样＞H3PO4处理后油样＞未处理油样。这可能是亚油酸中的双键受碱作用影响比较大，在加热过程中更容易发生异构化，产生一定量的反式亚油酸。

图1 在220 ℃的温度下反式亚油酸的含量Fig.1 The content of trans linoleic acid at 220 ℃

2.1.2 在240 ℃条件下加热大豆油脂的结果 将H3PO4处理后的油脂样品，NaOH 处理后的油脂样品，未经处理的油脂样品，分别置于油浴锅中加热，研究3 种样品在240 ℃的条件下分别加热2，4，6，8 h 后3 种反式亚油酸的含量，其变化规律如图2所示。

图2 在240 ℃的温度下反式亚油酸的含量Fig.2 The content of trans linoleic acid at 240 ℃

从图中可以得出，随着加热时间的不断增加，反式亚油酸的含量不断增加，经过酸、碱处理后的加热油脂也随着加热的时间的增加，相差越大；当加热至8 h 时，经过NaOH 处理后的加热油脂产生的C18∶2-9t，12c 最多，可达1.07%。

2.1.3 在260 ℃加热条件下大豆油脂产生的反式亚油酸 将H3PO4处理后的油脂样品，NaOH 处理后的油脂样品，未经处理的油脂样品，分别置于油浴锅中加热，研究3 种样品在260 ℃的条件下分别加热2，4，6，8 h 后3 种反式亚油酸的含量，其变化规律如图3所示。

与图1和图2相比，从图中可知，随着加热温度的增加，这3 种反式亚油酸的含量也随着增加，说明温度是不饱和脂肪酸热致异构化的主导和最关键因素，反应温度越高，顺式双键活性越高，越容易克服反应能垒，产生的TFA 越多。这与Liu[25]，Meiyan Yang[26]，Tsuzuki[27]等的研究结果的趋势一致。当油脂在260 ℃条件下进行加热8 h时，产生的反式单亚油酸（C18∶2-9c，12t）最多，可达1.222%。这可能是酸或碱处理和温度的增加使其中不饱和脂肪酸发生异构化和双键重排产生反式酸几率增加。

2.2 加热过程中反式亚油酸的异构化的能垒分析

2.2.1 油脂中顺-反双键的静电势分析 利用Gaussian09 软件，采用B3LYP/-311++g** 的计算级别，对油脂中的顺式、反式双键进行静电势图分析，其分析结果如图4所示。

图4 顺-反模型静电势图Fig.4 Cis-trans model electrostatic potential

从图中可以得出，顺式双键与反式双键的静电势分布具有显著差别，由图4a 可知，顺式双键中两个H 位于碳碳双键的一侧[28]，等静电势面包覆体积小，当受到外界条件进攻时所需越过的能垒小，并且进攻时在空间上的取向要求宽松。而从图4b 可得，反式双键中两个H 位于碳碳双键的两侧[29]，等静电势面包覆体积大，当受到外界条件进攻时所需越过的能垒较高。从定性的角度分析，顺式分子比反式分子更加容易发生改变，这与李安等[30]的研究结果一致。因此很好地解释了在外加的环境条件下（如加热、酸处理、碱处理），不饱和脂肪酸向能量更低、分子更稳定的转化。

2.2.2 常规加热过程中反式亚油酸的异构化的能垒分析 在240 ℃条件下加热未处理的油脂4 h，利用Gaussian09 软件，采用B3LYP/-311++g** 的计算级别，得到油样异构化的能量途径变化，其分析结果如图5所示。

从图中可以看出，两种过渡态处在反应势能面的鞍点位置，其一端连接反应物，另一端连接产物。单反式异构体和分别处在势能曲线的极小值点，均为异构化形成的中间产物。顺式亚油酸跨越一座能垒异构化形成单反式亚油酸后，再继续克服一座能垒而形成双反式亚油酸。顺式亚油酸变成全反式亚油酸需要跨越两个能量，分别为235.986，223.846 kJ/mol，这也解释了上述3 种反式亚油酸中，单反式亚油酸的含量要多于双反式亚油酸的含量。

2.2.3 强酸条件下加热过程中反式亚油酸的异构化的能垒分析 在240 ℃条件下加热将H3PO4处理后的油脂样品4 h，利用Gaussian09 软件，采用B3LYP/-311++g** 的计算级别，得到油样异构化的能量途径变化，其分析结果如图6所示。

从图中可以看出，顺式亚油酸变成全反式亚油酸需要跨越两个能量，当顺式亚油酸跨越一座能垒异构化形成单反式亚油酸后，需跨越232.812 kJ/mol 能量，当单反式亚油酸跨越一座能垒异构化形成全反式亚油酸后，又需要跨越219.379 kJ/mol。与图4相比，两个能量都有所降低，分别降低了3.174，4.467 kJ/mol，说明强酸条件下处理后加热油脂中的顺式亚油酸更容易转变成反式亚油酸。

2.2.4 强碱条件下加热过程中反式亚油酸的异构化的能垒分析 在240 ℃条件下加热将NaOH 处理后的油脂样品4 h，利用Gaussian09 软件，采用B3LYP/-311++g** 的计算级别，得到油样异构化的能量途径变化，其分析结果如图7所示。

图7表示NaOH 处理后加热油脂中亚油酸异构化反应能量途径。从图中可以看出，当顺式亚油酸跨越一座能垒异构化形成单反式亚油酸后，需跨越225.471 kJ/mol 能量，当单反式亚油酸跨越一座能垒异构化形成全反式亚油酸后，又需要跨越214.173 kJ/mol。两个能量都低于图5和图6中的能量，说明NaOH 处理的加热油脂反式异构体的几率影响最强，加热油脂中的顺式亚油酸更容易转变成反式亚油酸的难易程度顺序为：NaOH 处理后油样＞H3PO4处理后油样＞未处理油样。这与加热试验中的气相色谱分析相一致。

3 结论

图5 常规加热条件下亚油酸异构化反应能量途径Fig.5 Energy pathway of linoleic acid isomerization under conventional heating conditions

图6 H3PO4 处理后加热油脂中亚油酸异构化反应能量途径Fig.6 Heating oil in the linoleic acid isomerization reaction energy pathway after H3PO4 treatment

图7 NaOH 处理后加热油脂中亚油酸异构化反应能量途径Fig.7 Heating oil in the linoleic acid isomerization reaction energy pathway after NaOH treatment

温度是不饱和脂肪酸热致异构化的主导和最关键因素，3 种油样加热后产生反式亚油酸的顺序为：NaOH 处理后油样＞H3PO4处理后油样＞未处理油样。通过结构和能量变化途径理论揭示了直接异构化反应机理。基组水平上对反式双键异构化的静电势分析，从定性的角度分析了顺式分子比反式分子更加容易发生改变。通过亚油酸异构化反应能量确认了反应过渡态和反应途径，全顺式亚油酸向全反式亚油酸异构化过程包含4 个过渡态和2条途径；H3PO4处理或NaOH 处理均会降低加热过程中生成反式亚油酸的能量，其中强碱处理的降低的能量最大。从而进一步揭示了强酸或强碱处理对加热油脂异构化的反应机理。