西达本胺联合苦参碱对皮肤T细胞淋巴瘤细胞系增殖、凋亡的影响及可能的凋亡机制

何杏兰 王艺萌 王冠钰 张春雷

北京大学第三医院皮肤科 100191

皮肤T细胞淋巴瘤（cutaneous T-cell lymphoma，CTCL）是一种原发于皮肤的T细胞克隆增生性非霍奇金淋巴瘤。绝大多数CTCL病程较长，疾病发展缓慢，但目前尚缺乏治愈的方法［1］。西达本胺是我国自主研发合成的、拥有自主知识产权的选择性组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACi），在多种肿瘤的治疗上显示出良好的疗效及低毒性［2］。苦参碱为中药苦参的一种提取物，大量肿瘤细胞系及相关动物模型实验均显示其高抗肿瘤作用［3］。本研究旨在观察西达本胺和苦参碱对CTCL细胞系HH和Hut78增殖、凋亡的影响，并通过进一步检测细胞凋亡相关蛋白的表达，初步研究西达本胺联合苦参碱治疗CTCL的潜在机制。

材料与方法

一、细胞来源与试剂

HH细胞系（ATCC号CRL-2105），Hut78细胞系（ATCC号TIB-161），RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）、胎牛血清（美国HyClone公司），西达本胺（美国Selleck公司，目录号S8567），苦参碱（中国科学院成都生物研究所），MTS细胞增殖检测试剂盒（美国Promega公司），异硫氰酸荧光素-膜联蛋白Ⅴ（FITC-AnnexinⅤ）凋亡检测试剂盒（美国BD公司），兔抗人多克隆抗体胱天蛋白酶（caspase）3（美国Cell Signaling公司）、兔抗人多克隆抗体核因子（NF）κB p65、兔抗人单克隆抗体p-Bad、兔抗人单克隆抗体Bad、兔抗人单克隆抗体E钙黏蛋白（cadherin）、兔抗人单克隆抗体Bcl-2、鼠抗人单克隆抗体GAPDH（北京普利莱基因技术有限公司）。

将1 mg西达本胺粉末溶于2.5614 ml二甲基亚砜（DMSO）中配置为1 mmol/L储存液，置-20℃保存，使用前采用DMSO稀释至1 μmol/L。将100 mg苦参碱粉末溶于1 ml DMSO配置成100 g/L苦参碱液，-4℃保存。

二、细胞培养

HH、Hut78细胞在含10%胎牛血清和1%青链霉素的RPMI 1640培养基，37℃、5%CO2孵育箱中培养传代，取对数生长期HH、Hut78细胞进行后续实验。

三、MTS法检测西达本胺及苦参碱对HH、Hut78细胞增殖的影响

取对数生长期HH、Hut78细胞，计数后以2×104/ml接种于6孔板，每孔2 ml。实验药物浓度的选择参考本课题组前期研究［4-5］和预实验结果。2种细胞分别分为4组：西达本胺组（加入西达本胺使其终浓度为0.4 μmol/L）、苦参碱组（加入苦参碱使其终浓度为0.6 g/L）、联合组（加入终浓度为0.4 μmol/L西达本胺溶液后立即加入0.6 g/L苦参碱溶液）、对照组（仅加入DMSO），分别培养24、48、72 h。每个时间点混匀细胞，取100 μl细胞悬液至96孔板中，每组做3个复孔，每孔加入20 μl预先配置的MTS溶液，37℃孵箱中培养2 h，酶标仪测490 nm处吸光度（A值），重复测定3次。细胞增殖率 =［（A处理组-A培养基对照）/（A对照组-A培养基对照）］×100%。

四、流式细胞仪检测西达本胺及苦参碱对HH、Hut78细胞凋亡率的影响

取对数生长期HH、Hut78细胞，以2×104/ml接种至6孔板中。按上述分4组，处理HH、Hut78细胞48 h。每组计数5×105细胞，冷磷酸盐缓冲液清洗细胞2次，1×106/ml细胞重悬于结合缓冲液中。取100 μl细胞悬液至5 ml培养管中，每管加入人FITC偶联的AnnexinⅤ5 μl以及碘化丙锭5 μl。混匀，避光孵育15 min。每管加入400 μl结合缓冲液，1 h内用流式细胞仪检测。以上实验重复3次。细胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

五、Western印迹法检测西达本胺及苦参碱对HH、Hut78细胞凋亡相关蛋白表达的影响

HH、Hut78细胞按上述分组处理48 h后，取106个细胞，离心后弃上清液，磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，加入蛋白裂解液并置于冰上，混匀。4℃震荡孵育1 h，4℃18 000×g离心15 min。收集上清液，用二喹啉甲酸（BCA）法蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。总蛋白溶液中加入蛋白电泳上样缓冲液，充分混匀，水浴锅中100℃煮沸变性5 min。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶每孔分别加入30 μg总蛋白或2 μl预染色蛋白质分子量标准标志（marker），90 V恒压40 min，蛋白进入分离胶后，130 V恒压电泳90 min。250 mA 90 min将电泳蛋白电转印至聚偏氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入目的蛋白一抗：兔抗人多克隆抗体caspase-3（1∶1 000）、兔抗人多克隆抗体NF-κB p65（1∶1 000）、兔抗人单克隆抗体p-Bad（1∶1 000），兔抗人单克隆抗体Bad（1∶1 000），兔抗人单克隆抗体E-cadherin（1∶10 000），兔抗人单克隆抗体Bcl-2（1∶1 000），摇床上4℃过夜。封闭洗涤缓冲液（TBST）洗涤3次，每次15 min，加入IRDye®800CW染料标记的山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗，室温孵育1 h，TBST漂洗3次，每次15 min。双红外激光扫描成像系统进行荧光显色、分析。以GAPDH为内参，使用Image J软件定量分析各条带灰度值。

六、统计学分析

结 果

一、西达本胺和苦参碱对HH、Hut78细胞体外增殖的影响

与对照组相比，西达本胺组、苦参碱组和联合组HH、Hut78细胞增殖率均有不同程度降低，见图1。HH细胞系重复测量方差分析显示，各处理组细胞增殖率有随时间变化的趋势（F=137.41，P＜0.001），且不同处理组间细胞增殖率差异有统计学意义（F=15.88，P＜0.05）。各处理组间两两比较显示，24 h时，联合组细胞增殖率与苦参碱组和西达本胺组相比，差异无统计学意义（LSD-t=1.84、3.12，P=0.12、0.21）；48、72 h时，联合组细胞增殖率显著低于苦参碱组（LSD-t=4.90、2.64，均P＜0.05）和西达本胺组（LSD-t=4.89、6.32，均P ＜0.05）。

Hut78细胞系各处理组细胞增殖率有随时间变化的趋势（F=138.69，P ＜0.001），且不同处理组间细胞增殖率差异亦有统计学意义（F=558.26，P ＜ 0.001）。各处理组间两两比较显示，24、48、72 h时，联合组细胞增殖率均显著低于苦参碱组（LSD-t=2.60、10.18、14.93，均P ＜ 0.05）和西达本胺组（LSD-t=6.56、4.86、4.71，均P ＜ 0.05）。见图1。

图1 西达本胺和苦参碱单药或联合处理对HH、Hut78细胞增殖活力的影响 西达本胺、苦参碱单药或联合处理均使HH、Hut78细胞增殖率有不同程度降低，且各处理组细胞增殖率有随时间延长逐渐降低的趋势。24 h时，各处理组间HH细胞增殖率无明显差异，但48、72 h时联合组低于苦参碱组和西达本胺组；24、48、72 h时，联合组Hut78细胞增殖率均低于苦参碱组和西达本胺组

二、西达本胺和苦参碱对HH、Hut78细胞凋亡的影响

48 h时，西达本胺组、苦参碱组、联合组和对照组HH细胞凋亡率差异有统计学意义（F=10.22，P＜0.05）。两两多重比较显示，苦参碱组、西达本胺组与对照组相比差异无统计学意义（LSD-t=1.97、1.69，P=0.20、0.27），苦参碱组与西达本胺组相比差异亦无统计学意义（LSD-t=0.29，P=0.84），但联合组显著高于对照组、苦参碱组和西达本胺组，差异有统计学意义（LSD-t=7.37、5.40、5.69，均P ＜ 0.05）。见图2、表1。

西达本胺组、苦参碱组、联合组和对照组Hut78细胞凋亡率差异有统计学意义（F=32.36，P＜0.05）。两两比较显示，苦参碱组、西达本胺组和联合组均显著高于对照组（LSD-t=4.76、5.31、13.69，均P＜0.05），且联合组仍显著高于苦参碱组和西达本胺组（LSD-t=8.93、8.37，均P ＜ 0.01）。见图2、表1。

三、西达本胺和苦参碱对HH、Hut78细胞凋亡相关蛋白表达的影响

图2 流式细胞仪检测西达本胺、苦参碱单药或联合对HH、Hut78细胞凋亡的影响 48 h时，联合组HH细胞凋亡率高于对照组、苦参碱组和西达本胺组，而对照组、苦参碱组和西达本胺组间无明显差异；苦参碱组、西达本胺组和联合组Hut78细胞凋亡率均高于对照组，且联合组高于苦参碱组和西达本胺组

表1 西达本胺、苦参碱单药或联合对HH、Hut78细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达的影响（±s）

表1 西达本胺、苦参碱单药或联合对HH、Hut78细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达的影响（±s）

注：a与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。caspase-3：胱天蛋白酶3

组别 细胞凋亡率（%） 细胞凋亡相关蛋白表达E钙黏蛋白p65Bad p-Bad Bcl-2caspase-3剪切体HH细胞系对照组苦参碱组西达本胺组联合组F值P值Hut78细胞系对照组苦参碱组西达本胺组联合组F值P值11.44±1.43 13.98±3.86 13.61±1.62 20.94±0.64a 10.22＜0.05 2.06±0.27 1.61±0.23 1.28±0.10a 0.76±0.12a 24.83＜0.05 2.90±0.47 2.74±0.53 2.72±0.56 1.46±0.24a 6.196＜0.05 2.89±0.86 2.96±0.72 2.64±0.60 2.76±0.70 0.11 0.95 1.50±0.11 1.27±0.09 1.16±0.19 0.83±0.06a 12.64＜0.05 3.68±0.49 3.12±0.33 2.90±0.19 2.06±0.09a 13.71＜0.05 0.77±0.14 0.79±0.16 0.90±0.04 1.27±0.17a 8.58＜0.05 8.42±4.23 20.98±1.53a 22.44±7.74a 44.53±1.85a 32.36＜0.05 3.91±0.23 3.11±0.49a 2.63±0.23a 1.78±0.43a 22.08＜0.05 3.34±0.20 2.56±0.18a 2.53±0.36a 1.46±0.34a 22.15＜0.05 2.72±0.39 2.44±0.32 2.15±0.22 2.10±0.09 2.78 0.11 1.97±0.18 1.23±0.35a 1.26±0.16a 0.49±0.28a 16.64＜0.05 1.25±0.07 0.94±0.12a 0.79±0.17a 0.32±0.10a 30.67＜0.05 1.02±0.15 1.37±0.05 1.48±0.14a 2.09±0.17a 32.63＜0.05

图3 Western印迹法检测西达本胺、苦参碱单药或联合对HH、Hut78细胞凋亡相关蛋白表达的影响 苦参碱、西达本胺单药或联合处理48 h后，Hut78细胞caspase-3剪切体蛋白表达有不同程度升高，而E钙黏蛋白（cadherin）、p65、p-Bad、Bcl-2蛋白表达有不同程度降低，Bad蛋白表达基本无差异；HH细胞联合组caspase-3剪切体蛋白表达明显升高，而E-cadherin、p65、p-Bad、Bcl-2蛋白表达明显降低，4组间Bad蛋白表达无明显差异

如图3、表1所示，HH细胞中，联合组caspase-3剪切体蛋白表达显著高于对照组、苦参碱组和西达本胺组（LSD-t=6.37、5.98、4.67，均P ＜ 0.05），而E-cadherin（LSD-t=11.82、7.80、4.78）、p65（LSD-t=5.36、4.76、4.12）、p-Bad（LSD-t=9.70、6.35、4.84）及Bcl-2蛋白（LSD-t=8.92、5.84、4.64）表达显著低于其他3组（均P＞0.05）。4组间Bad蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组相比，苦参碱组、西达本胺组caspase-3剪切体蛋白、p65、p-Bad和Bcl-2蛋白表达差异无统计学意义（均P＞0.05），且苦参碱组E-cadherin蛋白表达差异亦无统计学意义（LSD-t=4.02，P=0.08），而西达本胺组E-cadherin蛋白表达显著低于对照组（LSD-t=7.036，P ＜ 0.05）。

Hut78细胞中，苦参碱组、西达本胺组和联合组E-cadherin（LSD-t=4.57、6.97、11.75）、p65（LSD-t=4.74、4.94、11.46）、p-Bad（LSD-t=5.01、4.76、9.99）、Bcl-2蛋白（LSD-t=4.55、6.65、13.47）表达均显著低于对照组（均P＜0.05）。苦参碱组caspase-3剪切体蛋白表达与对照组相比差异无统计学意义（LSD-t=4.50，P＞0.05），而西达本胺组和联合组显著高于对照组（LSD-t=5.90、13.72，均P ＜ 0.05），联合组显著高于苦参碱组和西达本胺组（LSD-t=9.22、7.82，均P ＜ 0.05）。联合组E-cadherin、p65、p-Bad、Bcl-2蛋白表达显著低于苦参碱组（LSD-t=7.18、6.72、4.98、8.92，均 P ＜ 0.05）和西达本胺组（LSD-t=4.78、6.52、5.19、6.82，均P ＜ 0.05）。4组间Bad蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

讨 论

CTCL是一组表现多样的结外霍奇金淋巴瘤，虽然其治疗方法多样，但并无完全治愈的方法，因此探索具有更好疗效的药物至关重要［6］。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）与许多肿瘤发生有强相关性，目前已成为肿瘤研究的热点方向。其抑制剂HDACi可通过抑制细胞周期和DNA修复、诱导细胞凋亡等方式抑制多种肿瘤细胞增殖，在肿瘤治疗方面显示出极大的潜力［7］。西达本胺是我国自主研发合成的选择性HDACi，能选择性抑制HDAC-1、2、3、10，毒性低，并被证实对多种肿瘤均有良好的治疗效果［2］。一项西达本胺治疗79例难治性、复发性皮肤外周T细胞淋巴瘤患者的Ⅱ期临床试验显示，治疗后患者中位生存时间提高，可达21.4个月［8］。西达本胺对CTCL也有明显抗肿瘤疗效，一项西达本胺治疗难治性CTCL患者的Ⅱ期临床试验显示，连续给药组总缓解率可达36%，且不良反应少［9］。本课题组前期研究［4］显示，西达本胺作用于CTCL细胞系可明显抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。苦参碱是一种豆科类植物苦参的提取物，具有良好的药理学活性。既往研究表明［3，10］，苦参碱在多种肿瘤的治疗上都有着良好的疗效，并显示出巨大的潜力。我们前期研究［5］显示，苦参碱能有效抑制CTCL细胞系HH增殖并诱导其凋亡。

我们采用西达本胺、苦参碱单药或二者联合体外干预人CTCL细胞系HH和Hut78，研究西达本胺和苦参碱对肿瘤细胞增殖与凋亡的影响。结果显示，西达本胺与苦参碱二者联合能显著抑制HH和Hut78细胞增殖并促进其凋亡。Western印迹结果显示，经西达本胺、苦参碱单药或联合处理HH和Hut78两个细胞系后，E-cadherin蛋白表达明显下调，而caspase 3剪切体的表达上调。E-cadherin是相对分子量为120 000的糖蛋白，大多分布于上皮细胞表面，目前有研究［11］发现，E-cadherin也可高表达于一些非霍奇金淋巴瘤的肿瘤细胞上。在多种肿瘤中，E-cadherin不仅对细胞间粘附发挥作用，也对凋亡的发生起关键作用。Galaz等［12］研究认为，E-cadherin的表达减少是诱导凋亡的一个重要触发点。E-cadherin表达下调能直接激活caspase-3，caspase-3激活后产生caspase-3剪切体从而执行细胞凋亡［13］。在尤因肉瘤、肝癌等多种肿瘤［14-16］中，E-cadherin表达下调可促进肿瘤细胞凋亡。结合既往文献报道，本研究结果提示，西达本胺联合苦参碱可能也通过抑制E-cadherin，激活caspase-3，产生caspase-3剪切体，从而诱导Hut-78、HH细胞凋亡。

Bad属于Bcl-2家族一员，是一种仅含BH3区域蛋白的促凋亡分子，Bad促凋亡作用由其丝氨酸磷酸化调控。细胞质中，磷酸化Bad与一种支架蛋白14-3-3结合，而无法与抗凋亡蛋白Bcl-2形成二聚体，进而无法发挥促凋亡作用；一旦细胞受到刺激，Bad立即去磷酸化，迁移至线粒体中与抗凋亡分子Bcl-2相结合形成复合体，从而抑制Bcl-2抗凋亡作用而诱导凋亡［17-18］。NF-κB是一种极为重要的介导细胞内信号转导的核转录因子，其与细胞凋亡发生也有密切关联。既往研究［19］显示，CTCL中NF-κB的激活与肿瘤细胞存活有明显正相关性。多种肿瘤研究［20-22］表明，抑制NF-κB的表达能下调Bcl-2蛋白的表达水平，通过激活下游caspase-3等分子而引发凋亡级联反应，从而起到抑制肿瘤生长的作用。Bcl-2与Bad一样，同属于Bcl-2蛋白家族，在细胞凋亡过程中发挥不容忽视的作用。目前最主流的Bcl-2调节凋亡模型认为，Bcl-2能与Bcl-2家族中其他促凋亡蛋白紧密结合，从而抑制细胞色素c的释放而使后续的凋亡级联反应无法进行［23-24］。本研究显示，西达本胺、苦参碱单药或联合处理HH、Hut78细胞后均可抑制p-Bad、p65、Bcl-2的表达。结合上述文献我们认为，西达本胺和苦参碱可能通过抑制p-Bad与NF-κB的表达，进一步干扰Bcl-2的表达，促进凋亡发生。

西达本胺或苦参碱单药对多种肿瘤作用机制的研究［25-28］显示，两药皆可通过下调Bcl-2、p65蛋白表达水平，进一步激活下游的caspase-3蛋白，从而抑制多种肿瘤生长。本研究结果显示，与单药组相比，西达本胺联合苦参碱对HH、Hut78细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用更明显，对凋亡相关蛋白caspase-3剪切体表达的升高及E-cadherin、p65、p-Bad、Bcl-2表达的降低作用均明显强于单药组，显示西达本胺联合苦参碱能协同抑制HH、Hut78细胞的生长。可能西达本胺与苦参碱在诱导CTCL细胞系凋亡的作用机制上有所重叠，联合用药比单药处理效果更加显著。与Hut78细胞上有白细胞介素（IL）-2受体全链相比，HH细胞仅有IL-2受体β + γ链［29-30］，对IL-2的亲和力要低于Hut78细胞。IL-2可通过激活JAK1和JAK3激酶参与CTCL的发生，而抑制IL-2能抑制信号传导及转录激活蛋白5（STAT5），从而抑制抗凋亡蛋白的产生，进而诱导细胞凋亡［31］。苦参碱和HDACi均能抑制IL-2的产生［32-33］。因此，我们推测苦参碱和西达本胺诱导HH细胞凋亡的作用不如Hut78细胞。

西达本胺联合苦参碱处理CTCL细胞系，可能通过抑制E-cadherin蛋白表达而激活caspase-3、产生caspase-3剪切体，从而促进凋亡，或通过抑制p65、p-Bad蛋白表达而干扰Bcl-2蛋白的表达，进而激活caspase-3，产生caspase-3剪切体，从而促进凋亡。本研究中我们仅对HH、Hut78两个细胞系进行了初步研究，后续将探索更多细胞系或进行动物实验，深入研究西达本胺与苦参碱联合作用于CTCL的机制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突