外源GABA对双孢蘑菇细胞壁代谢及木质化进程的影响

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(1.桂林理工大学化学与生物工程学院,广西桂林 541004;2.湖南省农业科学院农产品加工研究所,湖南长沙 410125)

双孢蘑菇(Agaricusbisporus)又名白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇等,不仅肉质鲜美,而且富含蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质等,具有很好的降血压、降血脂、抗肿瘤、抗菌、消炎护肝等多种保健价值[1-2]。然而双孢蘑菇在采后仍然进行着旺盛的呼吸、蒸腾、营养物质代谢等生理作用,因此菌体易发生失水萎蔫、褐变、破膜开伞等品质劣变现象,造成双孢蘑菇贮藏周期短,常温下仅可贮藏2～3 d[3]。质地是衡量双孢蘑菇商品价值的关键指标之一,刚采收的双孢蘑菇坚实而有弹性,但在贮藏过程中硬度逐渐降低,质地严重劣变[3]。研究表明食用菌硬度下降与细胞壁的加速代谢密切相关[4]。细胞壁是细胞的支撑物,可以维持细胞的形状,为细胞抵御外界渗透压、机械力提供了保护,与组织的软化和衰老密切相关[4]。与植物细胞壁不同,食用菌细胞壁主要成分为葡聚糖、几丁质和蛋白质,还有少量的木质素和纤维素[5-7]。随着贮藏时间的延长,细胞壁主要成分逐渐被降解,细胞壁结构破坏,同时,在水解酶类的作用下,细胞壁逐渐被降解,加速了组织软化与衰老[5-8]。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种四碳非蛋白氨基酸,广泛存在于生物体内,目前已被批准在食品中使用[9]。目前,关于GABA在果蔬采后品质变化上的应用研究还处于起步阶段。近年来的研究发现,外源GABA处理能够减轻CO2对番茄等果实的伤害[10]、诱导梨果实产生抗病性[11]、提高桃、香蕉等果实的抗冷性[12-13]、促进香蕉果实采后成熟[14]。李静等[15]发现GABA能够延缓双孢蘑菇硬度的下降,较好的保持其色泽和减少水分的蒸发。这些研究结果为将外源GABA应用于双孢蘑菇改善采后贮藏品质,如调节细胞壁代谢和减轻木质化提供了理论基础。

本文旨在研究5 mmol/L GABA处理对双孢蘑菇几丁质、纤维素、木质素含量以及细胞壁代谢、木质素合成的相关酶活性的影响,明确GABA对双孢蘑菇细胞壁代谢及木质化进程的作用,为深入研究GABA调控双孢蘑菇的作用机理提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

双孢蘑菇 采摘于全州新军生态菌家庭农场有限公司,于采摘当天转运至实验室,并于(5±1) ℃下预冷6 h,然后选取大小和成熟度均匀、颜色洁白、无开伞、无病虫害和机械损伤的双孢蘑菇进行实验;γ-氨基丁酸(GABA,99%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、纤维素等 均为国产分析纯。

WS-24电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司;3K30冷冻离心机 德国Sartorious公司;TU-1950紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 根据前期实验结果[15],常温(23±1) ℃条件下,将双孢蘑菇分别在清水和5 mmol/L的GABA溶液下浸泡5 min,取出,待双孢蘑菇表面的水分晾干后,装袋冷藏(4 ℃),每18个双孢蘑菇为一组,每个处理重复3次。分别于0、3、6、9、12 d取样,用液氮冻干粉碎后于-20 ℃冰箱贮藏备用。

1.2.2 GABA处理对几丁质代谢的影响

1.2.2.2 几丁质酶活力的测定 几丁质酶的提取和总酶活性的测定均参照曹建康等[17]的方法进行。酶液的提取:取2.0 g双孢蘑菇粉末样品,加7.0 mL冷的提取缓冲液(含1 mmol/L EDTA和5 mmol/Lβ-巯基乙醇的0.1 mol/L、pH5.2乙酸-乙酸钠),在低温冷浴下研磨均匀,将研磨好的样品离心30 min(4 ℃,12000×g),上清液移入透析袋中,放入蒸馏水中,于4 ℃透析12 h,将透析过的溶液再次离心15 min(4 ℃,10000×g),收集上清液,加入5倍冷的丙酮,于-20 ℃放置4 h,离心20 min(4 ℃,12000×g),弃去上清液,用预冷的丙酮漂洗两次,干燥沉淀物,加乙酸-乙酸钠(50 mmol/L、pH5.2)溶解,离心20 min(4 ℃,10000×g),上清液即为酶提取液。

酶活力的测定:0.5 mL乙酸-乙酸钠(50 mmol/L、pH5.2)、0.5 mL几丁质溶液(10 g/L)、0.5 mL酶提取液,37 ℃水浴60 min,加0.1 mL蜗牛酶(30 g/L),37 ℃水浴60 min。加0.2 mL四硼酸钾溶液(0.6 mol/L)、高温灭活,加2 mL稀释的对二甲氨基苯甲醛,水浴20 min(37 ℃),于585 nm处测吸光值。对照样吸光度的测定与上基本相同,仅在加酶提取液时先灭活。根据N-乙酰葡萄糖胺法绘制标准曲线。酶活力以每克样品每秒钟催化产生的N-乙酰氨基葡萄糖的量来表示。

1.2.3 GABA处理对纤维素代谢的影响

1.2.3.1 纤维素含量的测定 参照商贺阳等[18]的方法并稍作修改。取烘干恒重的双孢蘑菇100 mg,加70 mL H2SO4(60%),放置20 min,加30 mL H2SO4(60%),对溶液稀释10倍,取2.0 mL稀释液,加0.5 mL蒽酮(2%),再加5.0 mL浓H2SO4,测定620 nm处吸光值。取100 μg/mL纤维素标准液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL,按上述步骤测吸光值,绘制标准曲线,根据方程计算纤维素含量。

1.2.3.2 纤维素酶活力的测定 纤维素酶的提取和酶活力的测定参照孙涵等[19]的方法进行。取2.0 g双孢蘑菇粉末,加10 mL 95%乙醇,在冷的条件下研磨均匀,冰浴10 min,离心(4 ℃,12000×g,20 min),沉淀物中加5 mL 80%乙醇,冰浴10 min,重复离心保留沉淀物,再加5 mL提取缓冲液(含1.8 mol/L的NaCl的50 mmol/L、pH5.5的乙酸-乙酸钠),冰浴提取20 min,离心,上清液即为酶提取液;取0.9 mL羟甲基纤维素钠(10 g/L)、0.3 mL酶提取液,37 ℃水浴60 min,然后加0.9 mL 3,5-二硝基水杨酸,高温灭酶活,于540 nm处测吸光值,对照组的不同在于加的是灭活的酶提取液。3,5-二硝基水杨酸法绘制葡萄糖标准曲线,酶活力以每克样品每小时催化产生的葡萄糖的量来表示。

1.2.4 GABA处理对双孢蘑菇木质素代谢的影响

1.2.4.1 木质素含量测定 参照Bruce等[20]的方法测定木质素含量。取5.0 g双孢蘑菇粉末,加5 mL 95%的乙醇研磨均匀,3000×g离心7 min。用95%乙醇多次洗涤沉淀物,再用乙醇-正已烷(1∶2，V/V)多次洗涤沉淀物,烘干干燥,溶解于0.5 mL 25%的溴乙酰中,70 ℃水浴0.5 h,加0.9 mL 2 mol/L NaOH、5 mL冰乙酸和0.1 mL 7.5 mol/L盐酸羟胺,离心(1000×g,7 min),于280 nm处测吸光值。取1 mg/mL的木质素标准液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL,按前上述步骤测吸光值,绘制标准曲线,根据标准曲线方程计算木质素含量。

1.2.4.2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力的测定 苯丙氨酸解氨酶的提取和酶活力的测定参照李静等[15]的方法进行。

(2) Trypsinogen-1: Trypsin is a member of the serine protease family composed of three trypsinogen genes(trypsinogen 1, 2 and 4) with a potential role in cancer invasion[44,45]. These family members are sharing same nucleotide structures above 90% with each other.

1.2.4.3 肉桂醇脱氢酶(CAD)活力的测定 肉桂醇脱氢酶的提取和酶活力的测定参照姜天甲[21]的方法进行。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 GABA处理对双孢蘑菇几丁质代谢的影响

几丁质是由N-乙酰葡糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖,是构成真菌细胞壁的主要成分,其与纤维素共同构成细胞壁骨架[5-7]。几丁质含量一定程度上反映了细胞壁的完整度,Zivanovic等[7]曾报道几丁质含量的增加与双孢蘑菇的韧性呈正相关(r=0.95)。孙涵等[19]研究表明,气调处理双孢蘑菇能减缓其几丁质的降解,维持细胞壁一定的完整性。几丁质酶是一种能降解真菌细胞壁几丁质的酶,可作用于几丁质多聚体中的β-1,4-糖苷键,使之水解形成N-乙酰葡糖糖胺单体。几丁质酶过于活跃则会使几丁质含量迅速降解,严重损坏细胞壁,加快品质的劣变[5-7,16-17]。

图1和图2分别表示双孢蘑菇贮藏过程中几丁质含量和几丁质酶活力的变化,从图1中可知,随着双孢蘑菇贮藏时间的推移几丁质含量逐渐下降,但GABA处理过的双孢蘑菇的几丁质含量下降速度小于对照组的下降速度,且处理组的几丁质含量显著高于对照组(P<0.05),这说明GABA处理能够抑制几丁质的分解。从图2中可以看出,在双孢蘑菇的贮藏期间,几丁质酶活力呈上升的趋势。处理组和对照组的变化趋势基本一致,但是处理组的几丁质酶活力一直低于对照组,而且两者之间的差异显著性随着贮藏时间逐渐增强,这说明GABA处理能抑制几丁质酶的活力。结合图1几丁质含量的变化趋势,说明GABA(5 mmol/L)处理能够通过抑制几丁质酶的活力来降低几丁质的降解速率。

图1 GABA处理双孢蘑菇对几丁质含量的影响Fig.1 Effects of GABA treatmenton chitin content of A. bisporus

图2 GABA处理双孢蘑菇对几丁质酶活力的影响Fig.2 Effects of GABA treatmenton chitinase activity of A. bisporus

2.2 GABA处理对双孢蘑菇纤维素代谢的影响

纤维素是构成细胞壁的主要成分,与木质素、果胶、半纤维素等共同构成细胞壁,它能维持细胞的形态,在一定程度上起到保护细胞不被破坏[8,19,21]。过高的纤维素含量会使果蔬木质化严重,韧性增强,适中的纤维素含量不仅能提高食用的口感,而且能够增强食物的贮藏品质[21-22]。陈素芹[23]研究发现,双孢蘑菇在15 ℃贮藏4 d后才开始发生自溶,此时纤维素含量不断上升,最高含量达到鲜重的1.5%以上,随着自溶的加速,纤维素含量又呈下降趋势,纤维素含量的下降是蘑菇自溶的原因之一。图3表示双孢蘑菇贮藏过程中纤维素含量的变化,从图中可以看出,贮藏前3 d双孢蘑菇的纤维素含量略有下降,之后又迅速升高,可能与双孢蘑菇还未发生明显的自溶有关。贮藏前6 d处理组和对照组之间并无显著差异,贮藏后期处理组纤维素含量显著高于对照组(P<0.05),这说明在贮藏后期GABA处理能显著(P<0.05)抑制双孢蘑菇纤维素的降解。

图3 GABA处理双孢蘑菇对纤维素含量的影响Fig.3 Effect of GABA treatmenton cellulose content of A. bisporu

纤维素酶能使纤维素水解生成葡萄糖单体,其主要存在于成熟果实中[8]。研究表明,菇体自溶的原因之一是纤维素酶水解细胞壁组成物质纤维素,使细胞壁降解,菇体的自溶与纤维素酶活性呈正相关,与纤维素呈负相关,抑制纤维素酶活可有效的防止菇体自溶[23]。图4表示双孢蘑菇贮藏过程中纤维素酶活力的变化,从图4中可以看出,双孢蘑菇中的纤维素酶活力先上升再下降的趋势,在第6 d时出现最大值。在6～12 d时,处理组的纤维素酶活显著低于照组(P<0.05)。纤维素酶活力的变化可能与细胞自溶现象有关,细胞的自溶伴随着细胞壁的降解,细胞壁含有大量的纤维素,需要大量的纤维素酶,酶活力呈上升趋势,但随着时间的延长,大量的细胞自溶使得纤维素酶合成受阻,而且随着时间的推移酶的效力在下降,这使得纤维素酶活先升高后降低[23]。结合图3可知GABA处理能抑制纤维素酶的活性,进而抑制纤维素的分解。

图4 GABA处理双孢蘑菇对纤维素酶活力的影响Fig.4 Effect of GABA treatmenton cellulase activity of A. bisporus

2.3 GABA处理对双孢蘑菇木质素代谢的影响

2.3.1 GABA处理对双孢蘑菇木质素含量的影响 木质素是植物木质化的产物,是构成细胞壁次生结构的主要物质,它在木质组织有硬化细胞壁,增强细胞抗压的能力[20,22]。在果蔬中,木质素在膳食纤维中的作用十分重要,适中的含量能提高果蔬的品质[24]。双孢蘑菇在贮藏过程中,也易发生木质化现象,使得口感变差,有研究表明,通过保鲜技术处理双孢蘑菇可抑制双孢蘑菇木质化进程[8,19,23]。李静等[15]研究发现外源GABA处理能够使双孢蘑菇在贮藏过程中保持良好的硬度,由此推测GABA处理能影响双孢蘑菇木质素的积累,从而影响双孢蘑菇的木质化。图5表示双孢蘑菇贮藏过程中木质素含量的变化,从图中可以看出,在双孢蘑菇贮藏初期(0～6 d),木质素含量基本不变,对照组和处理组间的木质素含量并无差异,贮藏6 d后木质素含量迅速上升,但是9 d后处理组的木质素含量显著低于对照组(P<0.05),这说明在贮藏后期GABA处理能够有效抑制木质素的合成。

图5 GABA处理双孢蘑菇对木质素含量的影响Fig.5 Effect of GABA treatmenton lignin content of A. bisporus

2.3.2 GABA处理对双孢蘑菇PAL、CAD活性的影响 木质素合成的关键酶有PAL、CAD等。PAL是木质素合成的关键酶,能催化苯丙氨酸转化为肉桂酸或香豆醛生成醇。图6表示双孢蘑菇贮藏过程中PAL酶活力的变化,从图6可知,对照组和处理组的双孢蘑菇PAL酶活力均呈下降趋势。在3 d前两个处理之间的酶活力无显著差异,在3～6 d中,对照组PAL酶活力迅速下降,6 d后缓慢下降,而处理组则一直呈缓慢下降趋势,且活性显著高(P<0.05)于对照组,这说明GABA处理有利于保持双孢蘑菇PAL的活力。结合图5,GABA处理能够通过提高PAL的活性而降低木质素的积累。

图6 GABA处理双孢蘑菇对PAL活力的影响Fig.6 Effect of GABA treatmenton PAL enzyme activity in A. bisporus

CAD能将肉桂醇转化成前体物质进而合成木质素[19,25]。图7表示双孢蘑菇贮藏过程中CAD酶活力的变化,对照组和处理组双孢蘑菇CAD活力变化趋势一致,在贮藏初期,双孢蘑菇中的CAD活力变化不大,随着贮藏时间的延长,CAD活力迅速增大,9 d之后又有略微的下降,其中处理组的CAD酶活力始终低于对照组的活力,这说明GABA处理能抑制CAD的活力,进而降低木质素的积累,这一研究结果与孙涵等[19]的研究结果基本一致。

图7 GABA处理双孢蘑菇对CAD活力的影响Fig.7 Effect of GABA treatmenton CAD activity in A. bisporus

2.3.3 PAL、CAD活性与木质素合成的相关性分析 表1表示双孢蘑菇中的PAL、CAD活力与木质素合成的关系,由表1可以看出,对照组和处理组的木质素含量均与PAL活力呈极显著负相关(P<0.01),可能与PAL促进了双孢蘑菇多酚的积累有关[15]。CAD活力均与对照组和处理组木质素的含量呈极显著正相关(P<0.01),这一研究结果与姜天甲[21]和孙涵等[19]的研究结果一致,说明GABA能够通过提高PAL活力和抑制CAD活力来抑制木质素的合成,保持双孢蘑菇的品质。

表1 双孢蘑菇PAL、CAD活力与木质素含量的相关性分析Table 1 Correlation coefficients among PAL,CAD activity and lignin concents

注：*在P<0.05水平显著相关;**在P<0.01水平极显著相关。

3 结论

在贮藏过程中,双孢蘑菇的几丁质含量逐渐下降,而几丁质酶的活力呈上升趋势。GABA处理组双孢蘑菇的几丁质含量高于对照组,而几丁质酶活力却低于对照组,这说明GABA处理能抑制双孢蘑菇几丁质酶活力,进而抑制几丁质的降解,保持细胞膜的完整性。

双孢蘑菇的纤维素含量在贮藏初期稍有降低,3 d后快速上升,而纤维素酶的活力先缓慢上升,6 d后急剧下降,纤维素含量与纤维素酶活力的变化并不同步。贮藏3 d后GABA处理的双孢蘑菇纤维素酶活力低于对照组,而这一时期的纤维素含量却高于对照组,这说明GABA处理能够通过抑制纤维素酶的活力来促进纤维素的积累,使细胞维持良好的抗压力。

双孢蘑菇的木质素含量在贮藏初期变化不大,6 d后迅速上升,不断积累。在贮藏过程中,PAL活力逐渐下降而CAD活力逐渐增大。相关性分析表明,木质素含量与PAL活力呈极显著负相关(P<0.01),而与CAD活力呈极显著正相关(P<0.01)。GABA处理组木质素含量低于对照组,PAL活力高于对照组,而CAD活力却低于对照组,这说明GABA能够通过提高PAL活力和抑制CAD活力来降低双孢蘑菇木质素的积累,进而延缓其木质化进程。该研究明确了外源GABA对双孢蘑菇细胞壁代谢和木质化进程的减缓作用,可为有效抑制双孢蘑菇质地劣变提供理论依据。