协同发酵在植物乳杆菌发酵乳中的应用研究进展

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(1.江南大学食品学院,江苏无锡 214122;2.江南大学(扬州)食品生物技术研究所,江苏扬州 225004;3.江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122)

植物乳杆菌被广泛应用于发酵食品中,如干酪、发酵蔬菜、发酵肉类等[1],主要作用是为了提高产品风味以及延长保存时间[2]。近年来,该菌被发现具有众多益生作用,具有缓解肥胖症[3]、糖尿病[4]等慢性疾病的作用,因此广受关注。发酵乳是乳酸菌在食品中一个重要应用领域,除了能解决乳糖不耐症人群不能食用牛乳的问题,同时还是益生菌的良好载体[5]。但由于植物乳杆菌在牛乳中生长不佳,该菌在发酵乳中应用不多。本文综述植物乳杆菌生理特性尤其在牛乳中的生长不佳问题,及相关解决办法等方面的研究进展。旨在对植物乳杆菌在牛乳中生长不佳现象有系统的认识,并为植物乳杆菌应用提供参考。

1 发酵乳的生理功能及研究趋势

虽然牛乳中含有丰富营养物质,但患有乳糖不耐症的人群因缺乏乳糖酶,食用牛乳后会产生胃肠胀气、胃肠痉挛、腹泻等症状[6],而发酵乳是乳糖不耐症人群的良好选择,在发酵过程中,乳酸菌可以将乳糖转化成乳酸,从而降低乳糖不耐症的影响[7]。

发酵乳制品有很多种类,如酸乳(yoghurt)、发酵奶油(cultured cream)、发酵黄油(cultured butter)、酪乳(buttermilk)、干酪(cheese)、开菲尔(kefir)[8]。发酵乳中含有丰富营养物质,包括丰富蛋白质,矿物质钙(126～200 mg/100 g)、磷(138～170 mg/100 g),以及B族维生素(维生素B6、B12)和维生素D[9-10]。

发酵乳是益生菌的良好载体[5]。Linares等用StreptococcusthermophilusAPC151 生产含有γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的发酵乳,其具有缓解压力、抗焦虑作用[11]。Lee等成功将两株具有抗过敏功能的植物乳杆菌(L.plantarumSY11、SY12)应用于酸乳发酵[12]。

食品工业中生产酸乳的主要菌种是嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌,虽然嗜热链球菌有减轻幼儿腹泻症状[13]、抗感染[14]、抗氧化[15]的功能,但Fang等发现嗜热链球菌在pH2.0、2.5的模拟胃酸中培养1 h后无活菌存活[16],Campo通过分析定期饮用酸乳的114名健康年轻志愿者的粪便,表明由嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌发酵的酸乳不能为人体肠道提供有效数量的活菌,从而难以起到促进健康的作用[17]。为了使发酵乳具有更好的健康功能,近年对发酵乳的研究集中在功能性发酵乳。Elfahri等发现Lactobacillushelveticus1315发酵乳对结肠癌HT-29细胞有明显抑制作用(50.98%),且具有抗氧化作用[18];Chen等发现L.helveticusH9生产的发酵乳有很强的ACE(angiotensin-converting enzyme)抑制活性,能抗高血压[19];Chaves-López等用PichiakudriavzeviiKL84A、L.plantarumLAT3、EnterococcusfaecalisKL06协同发酵生产发酵乳,其ACE抑制活性强(IC50=30.63±1.11 mg/mL),且产品无苦味[20]。

2 植物乳杆菌生存特性及功能特性

2.1 来源及生存特性

植物乳杆菌是一类革兰氏阳性、兼性厌氧的乳酸菌,可在植物、土壤、人类或动物的排泄物以及发酵食品(发酵蔬菜、发酵肉制品、发酵鱼制品、干酪)等中发现,且该菌是人体肠道的原籍菌[21]。L.plantarumWCFS1是第一株被测定全基因序列的植物乳杆菌[22],其基因序列表明此菌中有众多糖代谢相关的酶,能有效利用多种碳源并对不同环境有很强的适应性[23]。植物乳杆菌的基因组在乳酸菌中是最大的(约3.3 Mb)[24],其中很多的基因与不同种类糖的调节、代谢、运输有关,Evanovich等表明该菌主要基因组中有1425个基因编码有关代谢的蛋白质,辅助基因组中有平均1320个基因编码有关细菌素生成、卤素分解、砷毒性降解、乳酸链球菌素抗性的蛋白质[25]。

植物乳杆菌具有独特的生理功能,Bergillos-Meca等发现L.plantarumC4作为辅助发酵剂生产发酵山羊乳,可提升多种矿物质(Ca、Mg)的生物活性(溶解性、渗透性、吸收性)[26]。Aguilar-Toalá等发现从植物乳杆菌发酵的发酵乳中提取的肽碎片具有抗感染、抗溶血、抗氧化的功能,其中小于3 kDa的肽碎片具有更高活性[27]。Wang等研究了L.plantarumYW32 产生的多糖(exopolysaccharide,EPS),其由甘露糖、果糖、半乳糖、葡萄糖组成,具有清除羟基和超氧自由基、抑制致病菌生物膜形成、抑制结肠癌细胞的作用[28]。

植物乳杆菌在干酪成熟过程中起到重要作用,能提高干酪中的游离氨基酸(free amino acid,FAA)含量,其是风味物质的重要前体[29],从而增强干酪的风味[30]。在亚洲国家中,该菌广泛应用于发酵蔬菜,包括腌黄瓜、腌萝卜、发酵橄榄、韩国泡菜、越南泡菜等[31]。该菌还可以在肉类(发酵牛肉香肠[32]、意大利香肠[33])、鱼类的发酵中应用[34-35]。

2.2 功能特性

传统上植物乳杆菌在食品中的应用是为了提高产品的风味,但近年来发现其具有众多益生特性,如Choi等人发现L.plantarumEM的细胞在存活、死亡状态都能吸附胆固醇,从而降低胆固醇水平[36]。Zago等研究发现植物乳杆菌能产生叶酸、核黄素,且在发酵乳中具有较好的抗氧化能力[37]。在治疗糖尿病方面,该菌被发现有独特作用,Bejar等发现L.plantarumTN627能保护胰脏组织,降低胰脏、血浆中α-淀粉酶活力,降低血糖,并缓解一系列糖尿病并发症[38];Abbasi等发现患有肾病的2型糖尿病病人饮用含有植物乳杆菌的豆乳后,各项肾功能指标明显提高[4]。该菌对于肥胖症也有重要作用,Xie等发现含有L.plantarumP1201的发酵豆乳能降低体重、减少体重的增加、肝和肠系膜的白色脂肪组织,改善高脂饮食引发的肥胖症[39];Park等发现L.plantarumQ180抑制胰脂肪酶,抑制前脂肪细胞3T3-L1的分化,从而抑制肥胖[40]。该菌吸附重金属功能近年来受到关注,如L.plantarumCCFM8246吸附铜[41],L.plantarumCCFM639吸附铝[42],L.plantarumCCFM8661吸附铅[43]。因此该菌在食品、药品中的应用的研究逐渐增多。

3 植物乳杆菌在发酵乳中的生长

虽然植物乳杆菌在多种食品中都有重要应用,但多个研究表明该菌在乳中很难生长,这使利用该菌生产发酵乳存在困难。而乳酸菌在乳中的生长情况与蛋白水解系统有很大关系。

3.1 乳酸菌蛋白水解系统

乳酸菌为了能在蛋白质丰富的环境中具备生长优势,在进化过程中逐渐形成了蛋白水解系统。蛋白水解系统的激活和培养环境中肽含量密切相关。Hebert等[44]认为当乳酸菌在含肽丰富的培养基中生长时,乳酸菌的蛋白酶活力将会降低,L.helveticusCRL1177在MRS培养基中生长时,细胞蛋白酶活力比在牛乳中生长降低了100倍。虽然牛乳中蛋白质含量较高,但能够被乳酸菌直接利用的游离氨基酸却很少,最多不超过100 mg/L[45]。因此,乳酸菌在牛乳等游离氨基酸含量匮乏的培养基中生长时,其蛋白水解系统会被激活。

表1 不同乳酸菌中编码CEP的基因Table 1 The genes that code CEP in different lactic acid bacteria

注：-表示该菌没有编码CEP的基因。

乳酸菌在乳中生长时,通过复杂的蛋白水解系统降解蛋白质,产生游离氨基酸,以满足自身的生长需要。蛋白水解系统主要由三部分组成:细胞壁蛋白酶(cell-envelope proteinase,CEP)将蛋白质水解成寡肽;转运系统将寡肽运送到细胞之内;然后细胞内的肽酶进一步将寡肽水解成短肽和游离氨基酸[46]。

乳酸菌的蛋白水解能力与CEP有重要关联。不同乳酸菌中编码CEP的基因数量、种类不同,如表1所示。虽然乳酸菌水解蛋白质是为了满足生长需求,但水解蛋白过程中会产生益生物质,这已引起众多研究的关注。瑞士乳杆菌发酵牛乳能产生抗高血压作用的两种多肽valyl-prolyl-proline(VPP)和isoleucyl-prolyl-proline(IPP)[47-48]。VPP和IPP能抑制血管紧张肽转换酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)活性,从而起到降高血压的作用[49-50]。因此具有高效蛋白水解系统的乳酸菌可应用于功能性食品。

3.2 植物乳杆菌蛋白水解系统

植物乳杆菌的蛋白水解系统不完备。Georgieva等研究从Bulgarian干酪中分离出的8株具有益生功能的植物乳杆菌,发现其有很高的氨基肽酶活性,但水解蛋白能力微弱[60]。Kleerebezem等研究发现植物乳杆菌中缺乏编码CEP的基因,但存在肽转运系统:寡肽运输酶(oligopeptidespermease,Opp)和二三肽运输体(di-and tripeptides transporter,DtpT),可以将胞外的肽转运到胞内,而且胞内具有众多肽酶,可进一步降解肽[23]。Liu等研究来源于发酵大豆的L.plantarum5-2的全基因组,发现有104个基因编码转运系统,其能转运肽、氨基酸,有19个基因编码不同特性的胞内肽酶,但并未发现编码CEP的基因[61]。

虽然大部分植物乳杆菌缺乏CEP,但最近研究发现少数具备CEP。Li等[62]的研究发现来源于健康婴儿粪便的L.plantarumZJ316中存在prtM编码CEP,Strahinic等发现来源于干酪的L.plantarumBGSJ3-18中存在类似prtP的基因编码CEP[63]。

3.3 植物乳杆菌利用多肽能力与生长情况

植物乳杆菌在乳中生长不佳,Georgieva等将8株植物乳杆菌在分别接种于脱脂乳,16 h后均不增殖[64]。Ma等的研究中,接种该菌的样品发酵72 h的pH仅达到5.81,且未出现凝乳现象[65],表明牛乳中游离氨基酸的量不能满足植物乳杆菌的生长需求。

虽在乳中生长不佳,但植物乳杆菌作为辅助发酵剂在干酪生产中占据重要地位。在干酪成熟过程中,该菌利用乳酸菌发酵剂(starter lactic acid bacteria,SLAB)产生的多肽进行次级水解,释放出更多小分子肽[66]。Poveda等[67]研究表明,向发酵剂中额外添加植物乳杆菌,能提高Manchego干酪中游离氨基酸含量,这表明,该菌能够水解进入细胞中的肽类物质,生成游离氨基酸。

植物乳杆菌被归类于非发酵剂乳酸菌(non-starter lactic acid bacteria,NSLAB)[68],干酪生产过程中,非发酵剂乳酸菌的生长受到发酵剂乳酸菌的促进,如乳酸乳球菌的蛋白酶阴性变种(proteinase negative,Prt-)的生长受到乳酸乳球菌蛋白酶阳性变种(proteinase positive,Prt+)的促进,如图1所示[69],Prt+变种提供肽和氨基酸,促进Prt-变种的增殖,但随着Prt-变种的大量繁殖,会争夺营养物质,从而抑制Prt+变种的生长。这表明干酪的发酵分为两个阶段:第一阶段,发酵剂乳酸菌产酸、水解蛋白质;第二阶段,非发酵剂乳酸菌利用产生的短肽和游离氨基酸进行生长。Aydemir等的研究也表明在干酪生产过程中,起初植物乳杆菌等非发酵剂乳酸菌数量很少,但在成熟后期能够在干酪中成为主导菌群[70]。

图1 乳酸乳球菌Prt+变种和乳酸乳球菌Prt-变种在干酪中的相互作用。Fig.1 The interaction between protease-positive(prt+)variants and protease-negative(prt-)variants of Lactococcuslactisin cheese注:(a)表示牛乳发酵时期,Prt+变种提供肽和氨基酸促进Prt-变种生长;(b)表示Prt-变种大量繁殖后,通过竞争营养对Prt+变种的抑制。灰色箭头代表促进生长以及提供,黑色箭头代表抑制生长。

这些现象表明,植物乳杆菌蛋白水解系统不完备,水解蛋白能力微弱,但可以利用环境中的多肽。可以考虑采用协同培养的方法,用蛋白水解能力强的乳酸菌将牛乳中蛋白质进行初步降解,产生多肽,植物乳杆菌可将这些多肽转运进细胞,用胞内肽酶进一步降解,从而满足自身生长的氨基酸需求。

4 植物乳杆菌在牛乳生长不佳的解决策略

4.1 添加蛋白水解酶

表2 协同发酵对部分乳酸菌生长情况的影响Table 2 The effect of co-culture on the growth of some lactic acid bacteria

由于绝大部分植物乳杆菌中缺乏编码细胞壁蛋白酶的基因,所以无法水解和进一步利用乳蛋白。因此可以尝试向牛乳中添加蛋白酶,促进乳蛋白的水解,从而促进植物乳杆菌对乳蛋白的利用和生长。Cagno等研究表明,多种发酵剂乳酸菌的细胞壁蛋白酶都能促进L.plantarumDPC2741在脱脂乳中的生长,而且促进程度表现为:Lactococcuslactissubsp.cremorisST2>L.helveticusPR4>S.thermophilesST8[71]。

4.2 添加氨基酸及其他营养物质

乳中营养物质(游离氨基酸)不能满足植物乳杆菌的生长,因此可以考虑额外添加。Ma等的研究已表明6种氨基酸和1种核苷酸前体是植物乳杆菌生长的必需物质,直接向牛乳中添加这些营养物质,促进该菌的生长[65]。Yang等的研究表明,黑莓汁在全部生长时间(24、48、72 h)都能明显促进植物乳杆菌在脱脂乳中的生长,促进增长量为2.74～4.20 log CFU/mL[72]。Robitaille等发现向牛乳中添加用胃蛋白酶处理的酪蛋白巨肽(caseinomacropeptide,CMP)可促进L.plantarum299 V生长[73]。但植物乳杆菌的不同株对于营养物质需求存在差异,且添加这些物质可能会影响产品最终品质,因此仍需进一步研究。

4.3 协同发酵

微生物群体之间的关系分为多种,竞争关系(competition)、互利共生(mutualism)、偏利共生(commensalism)、偏害共生(amensalism)、寄生(parasitism)等。协同发酵是利用微生物之间的关系以达到更好的发酵效果。在乳品工业中常用的关系有互利共生、偏利共生,如生产发酵乳最常用发酵菌种嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌之间是互利共生的关系,在发酵过程中利用彼此产物促进各自的生长[74]。干酪生产中,SLAB和NSLAB之间是偏利共生的关系,这种关系中一方受到另一方的促进,而另一方不受影响,SLAB初步水解蛋白质产生的多肽、游离氨基酸满足了NSLAB的氮源需求,促进其生长,而SLAB不受影响[75]。复合的微生物发酵剂有多方面的优势,一是发酵效果更好,这是由于微生物之间可以相互利用代谢物或交换信号分子,从而实现相互交流,产生更好的发酵效果;二是复合微生物群体能够对外界环境具有更强的耐受力[76-77]。利用协同发酵促进乳酸菌的研究可见表2。

为解决植物乳杆菌在乳中的生长问题,可借鉴干酪生产过程中的偏利共生关系的协同发酵。在这种关系中,具有较强蛋白酶活力的乳酸菌水解乳中的蛋白质,生成多肽和游离氨基酸,为植物乳杆菌生长提供氮源,促进其生长,而植物乳杆菌对蛋白酶活力强的乳酸菌生长无影响[75]。

5 可与植物乳杆菌协同发酵的乳酸菌

5.1 瑞士乳杆菌

瑞士乳杆菌被广泛应用于干酪、发酵乳等食品的生产。该菌能缓解干酪的苦味,这是因为该菌能分解其它微生物产生的苦味肽,并产生独特的风味物质,因此在干酪生产中具有重要的作用[86]。瑞士乳杆菌被认为具有益生功能,研究表明,L.helveticusH9发酵牛乳对小鼠有抗高血压作用[19],L.helveticusNS8能够缓解压力过大引起的系列病症[87]。

瑞士乳杆菌本身是多种氨基酸的营养缺陷型,而且在众多乳酸菌中是营养缺陷程度最高的一种,但该菌能在氨基酸稀少的牛乳中良好生长,这都归功于其强大的蛋白质水解能力。大部分的乳酸菌只有一种细胞壁蛋白酶(CEP),瑞士乳杆菌通常有至少两种细胞壁蛋白酶,另外,编码细胞壁蛋白酶的基因PrtM在该菌中也存在两种,而大部分乳酸菌中只有一种。由于数量众多的基因编码了其蛋白水解系统,才使该菌具有高效的蛋白水解能力[86]。

瑞士乳杆菌较强的蛋白水解能力对其他乳酸菌有显著的影响。Bergamini等研究表明L.helveticus138在干酪中初步水解产物可被L.plantarumI91有效利用,并促进其生长,而且发现L.plantarumI91对蛋白质的初级水解无影响,主要作用于次级水解(FAA的释放)[88]。

5.2 干酪乳杆菌

干酪乳杆菌存在于牛奶、干酪及其它乳制品,也存在于人类口腔、肠道中,并且是人体肠道中的原籍菌[89]。众多研究已表明该乳杆菌中存在细胞壁蛋白酶及完善的蛋白水解系统[54]。Lisa等研究表明,L.caseiPRA205发酵牛乳过程中,水解蛋白产生了ACE抑制肽VPP和IPP[90]。Kato-Kataoka研究表明定期饮用含有干酪乳杆菌的发酵乳能明显减轻由压力导致的肠道功能紊乱现象、缓解压力感,而且维护了肠道菌群的多样性[91]。该菌还有抑制肠道有害菌、调节免疫系统的作用[92]。丘裕等研究植物乳杆菌和干酪乳杆菌在火龙果汁中发酵,发现干酪乳杆菌对植物乳杆菌生长有促进作用,但其本身生长未受到影响[93]。

5.3 嗜热链球菌

嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的组合在发酵乳的生产中占据重要的地位,常常被用作主要的发酵剂。该菌可从乳制品、植物中收集得到[94]。嗜热链球菌适合在初始牛乳环境中生长,它能快速产酸,这是因为其具有两方面的能力:不仅能够水解牛乳蛋白为自身生长提供营养物质;而且能自身合成生长所需的氨基酸[95]。但这种合成氨基酸的能力并不是全能的,而是只能合成部分氨基酸[45],因此对于牛乳中蛋白质的水解也是其良好生长的必要能力。

部分嗜热链球菌具有蛋白水解酶[96]。Fernandez-Espla 等发现嗜热链球菌中存在蛋白水解酶PrtS、PrtS与其它乳酸菌中的蛋白酶如PrtP、PrtH、PrtB有很多相似之处,唯一的特异性是其蛋白酶中缺少B结构域[97]。当该菌单独在牛乳中生长时,PrtS起到重要作用。

嗜热链球菌与其他乳酸菌的协同发酵被广泛研究,其中包括植物乳杆菌。Morenomontoro等研究了嗜热链球菌和L.plantarumC4协同发酵山羊乳,发现嗜热链球菌促进L.plantarumC4在山羊乳中的生长(6 h内增长量约为0.90 log CFU/mL),L.plantarumC4对嗜热链球菌的生长无影响[98]。Turchi等用嗜热链球菌和植物乳杆菌协同发酵驴乳,发现植物乳杆菌能促进嗜热链球菌的生长(增长量约为1 log CFU/mL),但嗜热链球菌对植物乳杆菌的生长并无显著影响,其推测是植物乳杆菌的次级产物促进嗜热链球菌生长[85]。

5.4 保加利亚乳杆菌

嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的组合已经成为发酵乳生产中最主要的发酵剂,当它们在牛乳中发酵时,保加利亚乳杆菌水解酪蛋白产生的肽能被嗜热链球菌利用并促进其生长[99]。这表明保加利亚乳杆菌有较强的蛋白水解能力。

保加利亚乳杆菌中已经发现蛋白水解酶PrtB[100],Courtin等研究表明,嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的组合在牛乳中生长时,蛋白酶PrtB的存在对于嗜热链球菌的生长起到重要作用[101]。Mao等研究保加利亚乳杆菌水解酪蛋白情况,发现该菌CEP活性较高,水解酪蛋白并产生多种肽,但不同菌株之间存在较大差异[102]。该菌还能够水解乳清蛋白中的β乳球蛋白,产生抗氧化和抗高血压的活性肽[103]。

保加利亚乳杆菌与嗜热乳杆菌良好的协同发酵效果为其与植物乳杆菌协同发酵提供了参考。Cemile等研究保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌协同发酵,促进植物乳杆菌生长(增长量为0.2 log CFU/mL),且协同发酵乳中FAA含量较植物乳杆菌单一发酵有显著增长,表明植物乳杆菌利用了保加利亚乳杆菌产生的多肽,并产生FAA[104]。

5.5 乳酸乳球菌

乳酸乳球菌主要应用于发酵乳制品(酪乳、酸乳、酸奶油、干酪等),以及生产乳酸、B族维生素(B11、B12)、乳酸链球菌素(nisin)、以及多种酶制剂[105]。该菌有四个亚种:乳酸亚种(lactis)、乳脂亚种(cremoris)、霍氏亚种(hordniae)和 tructae亚种[106],最常见的是前两个亚种。

众多乳酸乳球菌中存在编码CEP的基因(主要是prtP)[107],但部分菌种缺乏这类基因,这可能菌种的来源有关,非乳源的菌种常缺乏CEP[108]。同时该菌还存在两种寡肽转运系统(Opp,Opt)[109]和小肽转运系统(DtpT),这保证其能进一步利用CEP产生的各种肽。

乳酸乳球菌与植物乳杆菌的协同发酵主要在干酪中应用。Ciocia等研究发现干酪中的植物乳杆菌可利用乳酸链球菌乳脂亚种、乳酸亚种水解蛋白产生的多肽和游离氨基酸,以满足自身生长需求,且urea-PAGE实验表明植物乳杆菌对于酪蛋白的降解无作用[110]。

6 展望

植物乳杆菌在牛乳中生长不佳的原因,一方面是牛乳中游离氨基酸含量低,不能满足植物乳杆菌生长需要;另一方面是植物乳杆菌蛋白水解系统不完善,缺乏重要的细胞壁蛋白酶,无法像其它那些在牛乳中生长良好的乳酸菌一样利用牛乳中的酪蛋白。

偏利共生关系的协同发酵是较好的解决办法,此方法在干酪生产中早已有良好应用。此方法利用蛋白酶活力强的乳酸菌水解牛乳中蛋白质,释放多肽,而植物乳杆菌利用这些多肽在胞内进行进一步水解生成氨基酸,满足生长需求。在这种协同发酵中,蛋白酶活性力强的乳酸菌参与蛋白质的初级水解、次级水解,而植物乳杆菌仅参与蛋白质的次级水解。

使用植物乳杆菌和其他乳酸菌协同发酵乳制品时,应注意乳酸菌的同一种下的不同株之间存在较大差异。同时为了在发酵乳中有良好的应用,协同发酵之后的产品应具有好的感官评定结果。