离子色谱电导法检测白酒、红酒、啤酒和 多种黄酒中的6 种阳离子

茅嘉田，周晚晴，Pavel N. NESTERENKO，叶明立，谢广发，陈梅兰,

（1.浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江 杭州 310028；2.莫斯科国立莱蒙诺索夫大学物理化学部化学系，俄罗斯 莫斯科 119991）

黄酒也称为米酒，属于酿造酒，在世界三大酿造酒中占有重要的一席，它有养胃健脾、和血行气、调经止痛等功效，适合冬天畏寒怕冷、四肢发凉者。黄酒中含有Li+、Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+等多种有益于人体健康的阳离子等，Na+和K+是保持人体电解质平衡的基础，适量的Li+能改善人体造血功能，提高免疫机能[1]，Mg2+可增强人体代谢时酶的活力，Ca2+可促进糖化，提高酶活性[2-3]，还能促进曲中酶的产生与溶出，使α-淀粉酶不易破坏[4]，NH4+的毒性未写明，但是氨水具有中等毒性，半数致死量（大鼠，经口）为350 mg/kg，已公布的吸入人体最低中毒质量浓度为408 mg/L[5]，超过一定量会对人体产生危害。

目前检测Li+、Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+的方法有原子吸收法[6-10]、电位滴定法[8]、分光光度法[9]、电感耦合等离子体质谱法[10-11]、毛细管区带电泳法[12-14]、离子色谱法[15-24]等。在这些方法中，离子色谱法可同时适用于白酒、啤酒、葡萄酒以及黄酒，分析速度快、灵敏度高、选择性好、能实现多组分同时分离定量等特点，简单、快速、准确，在应用中推广性强。

卢中明等[15]采用离子色谱法测定白酒中的Na+、K+、 Mg2+、Ca2+4 种阳离子含量，未检测Li+和NH4+。郭龑茹等[20]的实验测定啤酒样品中的8 种阴离子和5 种阳离子（Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+），但缺少Li+。马继平等[2]在20 min内完成啤酒中5 种阳离子的测定。 韩小江等[16]利用非抑制电导离子色谱法在25 min内分离出啤酒中的4 种阳离子和3 种胺类化合物，未检测其中的Li+。目前黄酒中主要研究对象为生物胺，而对黄酒中NH4+的研究鲜见报道。如张凤杰等[25]对黄酒酿造过程中生物胺的变化规律进行研究，以及在酿造的各个阶段探究生物胺的组成成分。

本实验建立离子色谱法同时测定酒中的金属阳离子Li+、Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+，并利用建立的方法检测市面上常见的18 种黄酒、3 种白酒、3 种啤酒和3 种葡萄酒的阳离子，对检测结果进行对比分析，对黄酒中较高含量NH4+的来源进行探讨，为黄酒的质量控制及酒类购买选择提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄酒、白酒、啤酒、葡萄酒 市购；焦糖色素由黄酒生产厂家提供。

实验用水为超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm） 美国 Millipore有限公司；氯化锂（分析纯） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；六水合氯化锶、硫酸钙、硫酸镁、氯化钠、硝酸钾、氯化铵（均为分析纯） 上海试四赫维化工有限公司。

1.2 仪器与设备

ICS-2100型离子色谱仪 美国Thermo Fisher公司； Ion Pac CS16阳离子分析柱（5 mm×250 mm）、Ion Pac CG16阳离子保护柱（5 mm×50 mm）、CERS-300（4 mm）阳离子抑制器、EGC III MSA淋洗液发生器和CR-CTC连续自动再生捕获柱、数据采集系统Chromeleon 6.8 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

取市售瓶装黄酒1 mL稀释10 倍后过0.45 μm滤膜和RP（Onguard）小柱（预先经甲醇和水活化），弃去初滤液，续滤液收集后进样分析Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+等离子的含量。若酒样底部有沉淀物，先放入50 ℃的恒温箱加热3 min使底部沉淀物溶解。Li+在样品中含量较低，采取直接处理后进样分析。

啤酒样品经超声脱气10 min，稀释5 倍后进行上述处理后进样；白酒样品不稀释直接前处理后进样；葡萄酒稀释20 倍后前处理进样，其中测NH4+含量不稀释处理后直接进样，所有样品溶液制备均用电阻率为18.2 MΩ·cm超纯水；焦糖色素比较黏稠，稀释100 倍后前处理再进样分析。

1.3.2 标准溶液的配制

分别称取6 种阳离子，置于100 mL容量瓶中，用超纯水定容，配制质量浓度为1 000 mg/L的贮备液，于4 ℃冰箱备用。分别移取一定量的贮备液至10 mL的容量瓶中，用超纯水定容，绘制阳离子的回归方程（Li+：0.005～1 mg/L；Na+：0.5～10 mg/L；NH4+： 1～40 mg/L；K+：5～100 mg/L；Mg2+：1～30 mg/L；Ca2+：1～50 mg/L）。

(3)其他利用职务阻碍解救被拐卖、绑架的妇女、儿童应予追究刑事责任的情形。该情形属于兜底情形，是对上述不完全列举的一种补充。其他利用职务阻碍解救的行为，是指除上述利用职权和利用职务上的便利以外，与上述情形相类似的行为，既可能是利用职权的行为，也可能是利用职务上的便利的行为，还可能两者兼而有之。

1.3.3 色谱条件

Ion Pac CS16阳离子分析柱（5 mm×250 mm）和Ion Pac CG16阳离子保护柱（5 mm×50 mm）；柱温42 ℃；检测器温度35 ℃；流动相：30 mmol/L甲基磺酸（淋洗液发生器自动生成）；进样量25 μL，以峰面积定量；流速1.0 mL/min；抑制电流88 mA。标准样品溶液的色谱峰见图1。

图 1 阳离子黄酒样品（a）与标准样品（b）（10 mg/L）对比图Fig. 1 Comparison of chromatograms of cations in yellow wine sample (a) and cation standards (b) (10 mg/L)

2 结果与分析

2.1 方法线性范围、重复性和检出限结果

用1 000 mg/L标准储备溶液配制6 种阳离子混合标准系列溶液，按1.3.3节色谱条件进样，以峰面积为纵坐标（Y），标准溶液质量浓度为横坐标（x）作标准曲线，并计算回归方程以及相关系数，结果表明6 种阳离子的相关系数R2均不小于0.999 0，可见方法具有良好的线性关系（表1）。

另取混合标准溶液（Li+：0.005 mg/L、Na+：0.5 mg/L、NH4+：5.0 mg/L、K+：10.0 mg/L、Mg2+：1.0 mg/L、Ca2+：1.0 mg/L）重复进样6 次，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），以3 倍信噪比计算得出各阳离子的检出限，结果见表1。

表 1 线性范围、重复性及检出限Table 1 Linear range, reproducibility and limits of detection for the developed method

2.2 方法的回收率结果

在待测黄酒样品5、18中加入3 种质量浓度水平的混合标准溶液，分别为样品质量浓度的120%、100%和80%左右。加标分2 次进行，Li+直接加标，含量较高的 Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+加标后稀释10 倍后再进行测定，结果见表2。

表 2 样品的加标回收率Table 2 Recoveries of spiked samples

2.3 黄酒样品测定结果

图 2 黄酒样品6的离子色谱图Fig. 2 Chromatograms of cations in yellow rice wine sample 6

考虑样品稀释10 倍过RP（Onguard）小柱后对样品可能吸附，因此实验对过RP（Onguard）小柱样品进行了加标回收实验，结果表明过RP（Onguard）小柱后的回收率在91.11%～108.76%之间，可见对待测阳离子并无吸附作用。样品经1.3.1节前处理后手动进样，外标法定量，测定的质量浓度结果见图2、表3。

表 3 黄酒样品中各阳离子含量Table 3 Concentrations of cations in yellow rice wine samples

2.4 其他有机胺的影响

考虑到黄酒因有机物非常复杂，可能存在其他有机胺，因此在1.3.3节色谱条件下进样6 种阳离子与6 种有机胺（甲胺、乙胺、二甲胺、丙胺、三甲胺、丁胺各为1 mg/L），如图3所示，阳离子标准样品色谱图中NH4+的保留时间为8.51 min，K+的保留时间为12.03 min，而有机胺标准样品色谱图显示有机胺出峰的位置为4～6，保留时间为9.54～11.51 min，可见有机胺并不影响NH4+和K+的检测。

图 3 阳离子标准溶液与有机胺标准溶液对比图Fig. 3 Chromatograms of mixture standard solution of six cations and mixture standard solution of six organic amines

2.5 黄酒中NH4+的来源探讨

2.5.1 焦糖色素的影响

图 4 焦糖色素阳离子色谱图Fig. 4 Chromatogram of cations in caramel pigment

2.5.2 黄酒酿造原料的影响

考虑黄酒中NH4+可能来自于酿酒过程，是原料中氨基酸及含氮化合物通过发酵，在微生物的作用下形成 NH4+[21]。因此分别对白酒、啤酒及葡萄酒3 种不同原料酿制的酒进行检测，结果见表4。酒样19、22、25的色谱对比图见图5。

表 4 白酒、啤酒和葡萄酒样品阳离子含量Table 4 Concentrations of cations detected in Chinese liquor, beer and red wine samples mg/L

从表4可知，白酒样品中NH4+低于检出限，且其余阳离子的检出质量浓度偏低，可能是由于白酒的制备方式属于蒸馏酒，仅通过较短时间的发酵和多次蒸馏技术[26]啤酒中22号和23两种品牌检出质量浓度为30～45 mg/L的 NH4+，但质量浓度大大低于黄酒中的NH4+，是黄酒中NH4+的13.28%～31.30%。24号啤酒是纯生啤酒，NH4+未检出，相对于熟啤酒酿造过程，纯生啤酒在整个酿造、过滤、包装全过程对污染微生物严格控制，是酵母的纯种发酵，这可能是未生成NH4+的原因。而3 种葡萄酒（分别来自西班牙、意大利和中国）也全部检测出NH4+，但质量浓度也大大低于黄酒，甚至比啤酒低，这可能原因是葡萄中粗蛋白含量较低（约为0.5%）[27]。

啤酒麦芽汁质量分数在10%～12%之间，相当于1.0 kg麦芽可以制作9.0 kg左右的啤酒，而1.0 kg大米可以酿造2.0 kg左右的黄酒，可见，啤酒的产量约为黄酒产量的4.5 倍，而黄酒中的NH4+含量平均值约为啤酒中NH4+含量的4～5 倍，而大米中粗蛋白含量（8.8%）略低于大麦中粗蛋白含量（9%～12%），两者浓度之间的关系说明酿造酒中NH4+主要来源于原料中的粗蛋白，粗蛋白在微生物的作用下把原料中的含氮化物最终转变成NH4+。

图 5 3 种类型酒样的离子色谱图Fig. 5 Chromatograms of cations in beer, Chinese liquor and wine

2.5.3 黄酒发酵程度（乙醇体积分数）对NH4+生成的影响

图 6 不同乙醇体积分数条件下NH＋4质量浓度Fig. 6 Variation in ammonium ion concentration in wines with different alcohol contents

乙醇由酵母发酵转化而来，由相关文献[30-31]可知，氮素营养是酵母菌进行正常乙醇发酵所必需的重要营养元素之一。乙醇发酵启动后，酵母菌优先利用铵态氮形式的氮源。是因为在初级发酵过程中，氮元素作为酵母细胞生长和新陈代谢的重要组成部分，常以营养素形式补充氮的发酵，并且无机氮比有机氮更容易被酵母消耗，即使在初级发酵过程中乙醇体积分数较高，也很容易被酵母吸收。而且在蛋白质水解过程中，如果污染了腐败细菌，会使蛋白质过度（异常）发酵，此时，蛋白质水解生成的氨基酸继续降解，或失去CO2生成胺类，或同时进行脱氨基和脱羧基反应，释放出游离 NH4+和NH3[28]。说明，发酵程度越好，乙醇体积分数越高，生成的NH4+也会越多。为了检验发酵程度与NH4+含量的关系，对比黄酒的乙醇体积分数与NH4+的含量， 见图6。随着乙醇体积分数的上升，NH4+的含量总趋势也是上升，可见发酵程度与NH4+的含量相关。

2.5.4 酿造方式及酒龄对NH4+的影响

实验选择了元红、加饭、善酿和香雪及酒龄分别为3、5、8、10 a及15 a的黄酒进行分析，结果发现，不同酿造方式和酒龄对黄酒成品中NH4+的含量无明显规律。

2.6 黄酒中的阳离子含量

对5 种品牌黄酒及同一品牌不同年份黄酒中阳离子含量进行分析，发现黄酒中Na+、K+、Ca2+、NH4+和Mg2+的浓度普遍较高，相比于同一水源地的自来水和地表水中的K+、Ca2+、Mg2+高出上百倍，最高的Ca2+质量浓度超过310 mg/L，其中地表水中NH4+含量极低，作为 黄酒酿造的自来水中的NH4+含量几乎为零[22]，而黄酒中NH4+质量浓度最高的达306.14 mg/L，可见黄酒中阳离子主要来源于酿造原料。白酒中NH4+未检出或低于检出限，Na+和Ca2+的含量相比黄酒相差30～270 倍左右。而葡萄酒Na+、Mg2+和Ca2+含量高于常规地表水2 倍多，K+含量普遍较高（超过1 000 mg/L），是黄酒中K+含量的2.62～6.38 倍。K+含量高的主要原因是葡萄（可食部分）本身K+含量较高，达到995 mg/100 g[29-32]。

3 结 论

综上所述，黄酒酿造以麦曲为糖化发酵剂，麦曲中含有丰富的微生物，所分泌的酶由于催化作用可加快蛋白质转变成氨基酸。由于细菌种类繁多，在微生物作用下使原料中蛋白质分解，产生游离NH3和CO2，这会导致NH4+的增加。其原因有待进一步研究，以明确其形成机理，以实现有效的控制。其次黄酒中阳离子普遍比同一水源地的自来水和地表水高出上百倍，尤其是K+、 Ca2+、Mg2+、NH4+，其中NH4+的差异尤为明显，地表水和自来水中含量极低甚至为0，但黄酒中可达 130～310 mg/L，可见，黄酒中阳离子含量高与水质无关，主要与酿造原料有关。不仅如此，发酵程度也会影响NH4+的含量，由于乙醇由酵母发酵转化而来，酵母菌会优先利用铵态氮形式的氮源，因此乙醇体积分数越高，发酵程度也越完全。随着乙醇体积分数的上升，NH4+的含量总趋势会上升，可见发酵程度与NH4+含量有关。