西青果多酚对甲基苯丙胺诱导PC12细胞损伤的保护作用及机制

(江汉大学武汉生物医学研究院,湖北武汉 430056)

甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是目前最常见且最具代表性的合成毒品之一[1]。近年来,METH的滥用趋势日益严重。长期滥用METH会使滥用者的前额叶皮层、海马及纹状体等脑区出现神经元损伤和核团萎缩,这与大脑功能变化,如情感认知、记忆障碍等关系密切,可能是METH产生精神损害的结构基础。METH滥用可引起动物大脑灰质减少、多巴胺能等神经元末梢损伤[2]和细胞凋亡[3-4]。此外,METH滥用可致体外培养的神经细胞凋亡[5]。目前,METH神经毒性的机制尚未完全明确[6-7]。研究显示氧化应激是METH所致神经损伤的重要作用机制之一。METH能使多巴胺(Dopamine,DA)水平升高,过量的DA可引起自由基如活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的不断生成[8],攻击生物大分子[9-10],进而引发下游级联反应最终产生神经毒性[11-12]。以往METH导致氧化应激主要是研究ROS引起脂质、蛋白质过氧化损伤,但是对于METH造成的DNA损伤的相关研究甚少。

研究表明,N-乙酰半胱氨酸等抗氧化剂对自由基引起的DNA氧化损伤具有显著的保护作用[13-15]。西青果多酚(Terminalia chebula polyphenol extract,TCPE)是本实验室前期从西青果中提取纯化的产物,经过体外综合评价,发现西青果多酚具有较强的抗氧化能力[16],而关于西青果多酚对METH神经损伤的保护作用目前尚无报道。

本研究以大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞为研究对象,建立体外PC12细胞METH损伤模型,并用不同浓度西青果多酚进行干预,探讨西青果多酚对METH诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其作用机制,以期为西青果多酚的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤(PC12)细胞 中国科学院昆明细胞库;甲基苯丙胺 湖北省公安厅;西青果多酚 本实验室提取[16];RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffered saline,PBS)、青/链霉素溶液 美国Gibco公司;MTT、DMSO、DCFH-DA荧光探针 美国Sigma公司;Muse Annexin V & Dead Cell试剂盒 德国Merck & Millipore公司;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒 南京建成生物工程研究所;GAPDH抗体(鼠抗)、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗 武汉博士德生物有限公司;γ-H2AX抗体(兔抗) 上海爱必信生物科技公司;ECL化学发光试剂 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1300 Series A2超净工作台、3308 CO2培养箱、Multiskan Go全波长酶标仪、Multifuge X1R冷冻离心机、Fluoroskan Ascent FL荧光酶标仪 美国Thermo Fisher Scientific公司;UP-250超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技有限公司;MuseTM流式细胞仪 德国Merck & Millipore公司;Olympus IX71倒置荧光显微镜 日本Olympus公司;Mini-Protean Tetra电泳槽、PowerPac Basic电源、Trans-Blot TurboTM转印系统 美国Bio-Rad公司;Gene Gnome 5化学发光成像系统 香港基因有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 西青果多酚制备及溶液配制 西青果多酚粉末由本实验室前期提取,冷冻干燥[16],样品中多酚含量为71.1%。将西青果多酚溶于无水乙醇制成100 mg/mL的西青果多酚储存液,再依次溶于1640完全培养基配制成不同终浓度的西青果多酚溶液,其浓度分别为6.25、12.5、25、50、100、200及400 μg/mL(无水乙醇浓度在不同终浓度的西青果多酚溶液中占比小于0.5%)。

1.2.2 细胞培养 采用RPMI-1640完全培养基(10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+0.1 mg/mL链霉素溶液)对PC12细胞进行培养。PC12细胞为贴壁细胞,当培养细胞达到一定数量,且呈对数生长时,用0.25%的胰蛋白酶消化后1000 r/min离心6 min,弃上清,加入1640完全培养基重悬细胞,将密度调整约为1×105个/mL,根据实验需要分别将细胞接种至96孔板(每孔100 μL)、6孔板(每孔2 mL)和培养瓶(每瓶5 mL)中。

1.2.3 细胞存活率检测 96孔板内细胞培养24 h后弃去原1640培养液,分别用不同浓度的西青果多酚(6.25、12.5、25、50、100、200及400 μg/mL)干预后检测细胞存活率,然后根据此实验结果筛选出的合适浓度的西青果多酚(25、50、100、200、400 μg/mL)与3 mmol/L METH混合后共同给药处理PC12细胞(100 μL/孔),每组6个重复。继续培养24 h。显微镜下观察细胞形态,随后每孔加入10 μL无菌的MTT溶液(5 mg/mL),置于培养箱中继续培养4 h,弃去培养液,每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)溶液,振荡混匀,通过酶标仪在570 nm波长检测各孔吸光度(OD)值,计算细胞存活率:

细胞存活率(%)=暴露组OD值/对照组OD值×100

1.2.4 细胞凋亡检测 6孔板内细胞培养24 h后弃去原1640培养液,加入不同浓度的西青果多酚(25、50、100和200 μg/mL)与3 mmol/L METH,继续培养24 h。将细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后离心,弃上清,用PBS洗两次,按照Muse Annexin V & Dead Cell试剂盒说明书处理细胞并染色30 min。随后用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.5 DNA损伤水平检测 6孔板内细胞培养24 h后加入不同浓度的西青果多酚(25、50、100、200 μg/mL)与3 mmol/L METH,继续培养24 h后消化离心进行彗星电泳实验[17]。细胞消化后用正常熔点和低熔点胶制成胶板。将胶板置于裂解液应用液(2.5 mol/L NaCl,100 mmol/L Na2EDTA·2H2O,10 mmol/L Tris,使用前加入1% TritonX-100,pH10)中,4 ℃避光裂解1.5 h。漂洗两次,电泳液(0.3 mmol/L NaOH和1 mmol/L Na2EDTA,pH>13)中4 ℃避光解旋20 min,25 V电压下电泳15 min。漂洗两次,中和液(0.4 mol/L Tris,pH7.5)中浸泡5 min,2.5 μg/mL溴化乙锭避光染色20 min。用荧光显微镜(激发波长515～560 nm)观察并拍照。结果使用CASP软件进行分析。

1.2.6 Western Blot检测细胞γ-H2AX蛋白表达水平 6孔板内细胞培养24 h后加入不同浓度的西青果多酚(25、50、100、200 μg/mL)与3 mmol/L METH,继续培养24 h,用胰蛋白酶消化收集细胞。按RIPA∶PMSF∶广谱磷酸酶抑制剂∶cocktail=100∶1∶1∶2的比例(体积比)配好裂解液,每组细胞沉淀加入100 μL裂解液,冰上裂解30 min,4 ℃、12000×g离心15 min,吸取上清用BCA法测量蛋白浓度。将蛋白样品沸水浴5 min变性。进行SDS-PAGE电泳,并将蛋白转移至PVDF膜。随后用5%脱脂奶粉振摇封闭1 h,分别加一抗后室温孵育1 h,4 ℃孵育过夜,TBST洗膜,加二抗室温孵育1 h,TBST洗膜,ECL化学发光试剂显色,化学发光成像系统成像观察并拍照[5]。用Image J软件处理图片,分析条带灰度值,进行归一化处理。

1.2.7 SOD、GSH-Px活性和MDA含量检测 培养瓶内细胞培养24 h后按上述实验中相同的给药和分组方法处理细胞,继续培养24 h后用胰蛋白酶消化后离心,弃上清,PBS重悬,超声破碎细胞,按照SOD、GSH-Px和MDA试剂盒说明书的要求,严格进行实验,每组设置3个重复,通过酶标仪检测OD值,按照说明书计算各组的SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

1.2.8 ROS水平检测 6孔板内细胞培养24 h后按上述实验中相同的给药和分组方法处理细胞,继续培养24 h,弃上清,PBS漂洗2次,随后加入终浓度为100 μmol/L的DCFH-DA,置于37 ℃的恒温培养箱中30 min,弃去上清,加入PBS漂洗3次。胰蛋白酶消化收集细胞,加入1 mL PBS重悬细胞,通过荧光酶标仪设置激发波长485 nm,发射波长538 nm测定各组荧光强度值[18],每组设置3个重复。分析各组荧光强度,进行归一化处理。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 西青果多酚对PC12细胞存活率的影响

如图1所示,与对照组相比,25～400 μg/mL西青果多酚干预组PC12细胞存活率极显著升高(P<0.01)。因此,用25～400 μg/mL西青果多酚进行后续实验。

图1 西青果多酚对PC12细胞存活率的影响(n=6)Fig.1 Effect of TCPE on the survival rates of PC12 cells(n=6)注:与对照组相比,**表示极显著(P<0.01)。

2.2 西青果多酚对METH诱导后PC12细胞存活率的影响

如图2所示,与对照组相比,3 mmol/L METH组PC12细胞存活率极显著下降(P<0.01)。与METH组相比,25 μg/mL西青果多酚处理组PC12细胞存活率显著升高(P<0.05),50、100、200、400 μg/mL西青果多酚处理组PC12细胞存活率极显著升高(P<0.01)。

图2 西青果多酚对METH染毒后PC12细胞存活率的影响(n=6)Fig.2 Effect of TCPE on the survival rates of PC12 cells after METH treatment(n=6)注:与对照组相比,*表示显著(P<0.05),**表示极显著(P<0.01);与3 mmol/L METH组相比,#表示显著(P<0.05),##表示极显著(P<0.01)。图3B、图4B、图5B、图6同。

2.3 西青果多酚对METH诱导后PC12细胞凋亡的影响

如图3所示,与对照组相比,3 mmol/L METH组PC12细胞凋亡率极显著升高(P<0.01);与3 mmol/L METH组相比,50、100、200 μg/mL西青果多酚均极显著降低PC12细胞的凋亡率(P<0.01)。以上结果表明西青果多酚能明显抑制METH诱导的PC12细胞凋亡。

图3 西青果多酚对METH染毒后的PC12细胞凋亡的影响(n=3)Fig.3 Protective effect of TCPE on apoptosis of PC12 cells after METH treatment(n=3)注:A:流式细胞仪凋亡代表图;B:PC12细胞凋亡结果统计图。

2.4 西青果多酚对METH诱导后PC12细胞DNA损伤的影响

如图4所示,与对照组相比,3 mmol/L METH组细胞尾部DNA含量百分比极显著升高(P<0.01);与3 mmol/L METH组相比,25、50、100、200 μg/mL西青果多酚组细胞尾部DNA含量百分比极显著降低(P<0.01),表明西青果多酚能明显抑制METH引起的PC12细胞DNA损伤。

图4 西青果多酚对METH染毒后的PC12细胞DNA损伤水平Fig.4 Effect of TCPE on DNA damage level in PC12 cells after METH treatment

2.5 西青果多酚对METH染毒后PC12细胞γ-H2AX蛋白表达的影响

如图5所示,与对照组相比,3 mmol/L METH组细胞γ-H2AX蛋白表达极显著升高(P<0.01),与3 mmol/L METH组相比,50、100、200 μg/mL西青果多酚组细胞γ-H2AX的蛋白表达极显著降低(P<0.01),表明西青果多酚对METH造成的DNA损伤具有明显的保护作用。

图5 西青果多酚对METH染毒后的PC12细胞γ-H2AX蛋白表达的影响Fig.5 Effect of TCPE on γ-H2AX expression in PC12 cells after METH treatment

图6 西青果多酚对METH染毒PC12细胞SOD、GSH-Px活力、MDA和ROS水平的影响(n=3)Fig.6 Effect of TCPE on SOD,GSH-Px activities,MDA and ROS levels of PC12 cells after METH treatment(n=3)

2.6 西青果多酚对METH染毒后PC12细胞SOD、GSH-Px活性和MDA、ROS水平的影响

SOD和GSH-Px是机体内重要的抗氧化酶,能够有效清除自由基[19-20]。MDA是脂质过氧化产物,也是氧化应激的重要指标之一[21]。如图6所示,与对照组相比,METH组细胞SOD和GSH-Px活力显著降低(P<0.05),MDA含量显著升高(P<0.05),ROS相对含量极显著升高(P<0.01),与METH组相比,25～200 μg/mL西青果多酚组细胞SOD活力极显著升高(P<0.01),GSH-Px活力显著升高(P<0.05),MDA和ROS含量极显著降低(P<0.01)。

3 讨论与结论

研究表明,METH滥用会使神经元细胞ROS升高,引起氧化应激,导致细胞凋亡[22-24]。DNA损伤与氧化应激密切相关,有文献报道METH能导致大鼠纹状体和伏隔核DNA损伤[25]。本实验结果发现,METH能明显增加细胞凋亡、DNA损伤、胞内MDA和ROS含量,降低细胞存活率、胞内SOD和GSH-Px活性,西青果多酚能明显抑制METH诱导的细胞凋亡、DNA损伤、胞内MDA和ROS含量增加,抑制METH诱导的细胞存活率、胞内SOD和GSH-Px活性下降。因此推测西青果多酚可能通过缓解METH导致的氧化损伤,减轻DNA损伤,从而对PC12细胞损伤起到保护作用。

本实验结果显示西青果多酚能明显提高PC12细胞的存活率,抑制METH造成的细胞凋亡,表明西青果多酚对METH引起的神经损伤具有保护作用。文献报道多酚类物质能通过抗氧化作用减轻过氧化氢引起的神经损伤[26-28],与本研究结果相似,因此西青果多酚的神经损伤保护作用可能与西青果多酚的抗氧化作用有关。

文献报道抗氧化剂能缓解自由基引起的DNA损伤[29-31],本研究中彗星试验结果显示西青果多酚能明显降低METH诱导的PC12细胞DNA损伤程度,Western Blot结果显示西青果多酚能明显降低METH诱导的DNA损伤标志蛋白的表达,表明西青果多酚对METH诱导的PC12细胞DNA损伤具有保护作用。前期研究表明葡萄籽提取物[32]、马蹄紫菀提取物[33]等可通过清除自由基,减轻自由基引起的DNA损伤,前期实验已发现西青果多酚具有很好的体外清除自由基能力[16],因此推测西青果多酚对METH引起的DNA损伤的保护作用可能与其提高细胞自由基清除能力有关。

此外,本研究还发现西青果多酚能显明显提高PC12细胞中SOD和GSH-Px活性,降低PC12细胞中MDA和ROS含量,这与文献报道中褪黑素能明显降低METH诱导的氧化应激、保护神经细胞[34]的结果相似。结合上述结果推测西青果多酚可能提高机体抗氧化酶活性,减少自由基的产生,抑制METH诱导的DNA损伤,从而起到对PC12细胞神经损伤的保护作用。

综上所述,本研究发现西青果多酚对METH诱导的PC12细胞损伤具有保护作用,主要表现在提高细胞存活率、SOD和GSH-Px活性,降低细胞凋亡率、DNA损伤水平、MDA和ROS含量。其作用机制可能是通过缓解氧化应激、降低PC12细胞DNA损伤实现。今后将进行动物体内实验进一步研究METH引起DNA损伤以及西青果多酚对METH神经损伤的保护作用及机制,为研究METH神经毒性机制和西青果多酚的进一步开发利用提供实验基础和理论依据。