蒸汽爆破预处理对山楂果渣组分及其酶解效果的影响

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(1.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳 550025;2.农业农村部规划设计研究院农产品加工工程研究所,北京 100125;3.贵州理工学院,贵州贵阳 550003)

山楂(CrataeguspinnatifidaBunge),蔷薇科植物,具有药食同源特性。据报道,山楂富含黄酮、多糖、多酚、有机酸、三萜、甾醇、胡萝卜素和氨基酸等活性成分,具有降压、增加冠脉流量、降血脂和抗动脉粥样硬化等作用[1-2]。山楂果渣是山楂加工主要副产物之一,主要成分是纤维素,且富含黄酮、膳食纤维等活性成分。目前,山楂果渣开发利用方面的报道很少且单一,主要用作牲畜饲料,如陈玉河[3]将山楂果渣、苹果渣、玉米秆青混合制成饲料,使得平均每头牛比单喂玉米秸青贮饲料的增加产奶量1.3 kg/d,比喂干玉米秸饲料的增加产奶量2.2 kg/d,且牛奶的品质无明显差异。全国每年有数以万吨的山楂果渣被丢弃,不仅造成资源的浪费,而且引起环境的严重污染,给山楂加工企业带来巨大的经济压力[4]。

目前,蒸汽爆破是预处理技术中应用比较广泛的方法之一,在高温、高压条件下处理物料,使高温饱和蒸汽迅速渗入到植物细胞中,并通过瞬间降压,将热能转化为机械能,使植物组织的细胞破裂、结构破坏等,以便于后期的加工、处理,并且这种方法对环境污染小,是一种高效、绿色和低成本的预处理技术[5-6]。Sheng等[7]研究表明蒸汽爆破可明显提高瘤胃微生物对玉米秸秆的降解率,且提高其作为牛饲料的营养价值。秸秆经蒸汽爆破后,纤维素和半纤维素降解率明显升高,表面粘附更多的微生物,易快速形成致密的微生物生物膜[8]。Tu等[9]对沙棘果渣进行蒸汽爆破预处理,结果表明,蒸汽爆破后的沙棘果渣表面呈皱状,卷曲状和多孔状;当蒸汽压力为2.0 MPa,持续时间为88 s时,沙棘总黄酮含量达到最大为24.7 mg/g,较原物料增加了246%。王永淼等[10]对柠条蒸汽爆破发现2.3 kPa处理过的柠条糖化率达到了91.1%,纤维素糖化率提高5.2倍,很大程度上提高了柠条的利用率。但是,蒸汽爆破预处理技术在山楂果渣方面的应用鲜有报道。

本文采用不同蒸汽爆破条件对山楂果渣进行预处理,探究蒸汽爆破预处理对山楂果渣的组分、酶解效果及其微观结构的影响。研究结果将为山楂果渣深加工提供理论依据,并有助于山楂果渣的开发利用,同时可为山楂副产品综合利用及加工过程产生的环境污染等问题提供一条有效的解决途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山楂果渣 承德市滦平种植基地提供;芦丁标准品 北京百灵威科技有限公司;亚硝酸钠、硝酸铝 西陇化工股份有限公司;氢氧化钠、浓硫酸 北京化工厂;无水乙醇、苯酚 国药集团化学试剂有限公司;纤维素酶 沧州盛夏酶生物技术有限公司;所有试剂均为国产分析纯。

QBS-80型蒸汽爆破机 鹤壁正道生物能源有限公司;GM-0.5隔膜真空泵 天津市津腾实验设备有限公司;HWS-26型电热恒温水浴锅 苏州江东精密仪器有限公司;UV-1700紫外分光光度计 北京晨曦勇创科技有限公司;RE-52B旋转蒸发仪 上海上自仪转速表仪表机电有限公司;AR223CN电子天平 奥豪斯仪器有限公司;JSM-7100F型场发射扫描电镜 常州乔纳机电科技有限公司;MD10 X射线衍射仪 上海纪革森实业有限公司;HZQ-C空气浴振荡器 东联电子技术开发技术有限公司;LDZX-50KBS型立体式高压灭菌锅 上海申安医疗器械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 山楂果渣蒸汽爆破预处理 对装入2/3蒸汽爆破机腔体的山楂果渣,分别选取压力2.0、2.4 MPa,保压时间30 s、1 min、2 min、4 min,进行蒸汽爆破预处理。收集爆破物料,60 ℃干燥,粉碎过80目筛,备用。

1.2.2 蒸汽爆破预处理条件下的山楂果渣纤维素、可溶性糖含量的测定

1.2.2.1 葡萄糖标准曲线的制作 分别精确吸取0.1 mg/mL葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL置于10 mL具塞试管中,以蒸馏水补至2.0 mL,依次加1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL浓硫酸,混匀,沸水浴反应10 min,冷却至室温,以零为对照,于波长490 mn处测定吸光度[11]。以吸光度为纵坐标,葡萄糖浓度为横坐标,得到标准曲线方程为y=0.0082x+0.0283,,R2=0.9991。

1.2.2.2 山楂果渣纤维素、可溶性糖的含量测定与计算 山楂果渣可溶性糖提取液制备:称取1.0 g不同蒸汽爆破预处条件下的山楂果渣粉末,分别置于50 mL试管中,加入10 mL蒸馏水,漩涡振荡10 min,真空抽滤得到可溶性糖溶液,用蒸馏水定容至100 mL,备用。

山楂果渣全水解溶液制备:称取1.0 g不同蒸汽爆破预处条件下的山楂果渣粉末,分别加入3.0 mL 72%浓硫酸,30 ℃水浴1 h,每间隔15 min振荡一次,然后加入84 mL蒸馏水,121 ℃处理1 h,定容至100 mL,备用。此方法[12]可以将纤维素全水解为可溶性糖。

参照1.2.2.1实验步骤测定山楂果渣可溶性糖和山楂果渣全水解液可溶性糖含量,计算公式如下:

式中:c-根据标准曲线计算待测液中可溶性糖的浓度,μg/mL;v-待测液总体积,mL;d-稀释倍数;M-山楂果渣粉末干重,g。

纤维素含量计算公式如下:

A3(%)=A1-A2

式中:A3-山楂果渣纤维素含量,%;A1-山楂果渣全水解液中可溶性糖含量,%;A2-山楂果渣可溶性糖含量,%。

1.2.3 蒸汽爆破预处理条件下的山楂果渣总黄酮提取量的测定

1.2.3.1 芦丁标准曲线的制作 分别精确吸取0.15 mg/mL芦丁标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL,移入15 mL具塞试管中,依次加入5.0 mL 30%乙醇溶液和0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液,摇匀,放置5 min,加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液,摇匀,放置6 min,然后加入2.0 mL 1.0 mol/L氢氧化钠溶液,用30%乙醇溶液定容至刻度。摇匀,放置15 min,以零为对照,于510 nm波长测定吸光度[13]。以吸光度为纵坐标,以芦丁浓度为横坐标,得到标准曲线为y=0.0014x+0.0441,R2=0.9910。

1.2.3.2 总黄酮提取量测定与计算 称取1.0 g不同蒸汽爆破预处条件下的山楂果渣粉末,置于索氏提取器中,加入100 mL 70%乙醇溶液80 ℃回流3 h,至提取液无色为止。冷却后,用25%乙醇溶液洗涤滤渣,合并滤液,用蒸馏水定容至250 mL,备用。分别吸取1.0 mL不同蒸汽爆破预处条件下的山楂果渣黄酮提取液,参照1.2.3.1 实验步骤测定总黄酮提取量,计算公式如下:

式中:X-山楂果渣总黄酮提取量,mg/g;B-根据标准曲线计算待测液中黄酮的浓度,μg/mL;M-山楂果渣粉末干重,g;V1-山楂果渣黄酮提取液测定体积,mL;V2-山楂果渣黄酮提取液总体积,mL。

1.2.4 酶解糖化参数的确定

1.2.4.1 最佳蒸汽爆破预处理条件的确定 称取1.0 g不同蒸汽爆破预处条件下的山楂果渣粉末分别置于250 mL锥形瓶中,加入 0.05 mol/L(pH4.8)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液至底物浓度为10%,纤维素酶量100 U/g,于 50 ℃、150 r/min 酶解糖化72 h;分别在酶解时间4、8、12、24、36、48、60、72 h取上清液,测定酶解糖化率,以酶解糖化率为衡量指标,确定其最佳蒸汽爆破预处理条件。

1.2.4.2 纤维素酶量的确定 在最佳蒸汽爆破预处理条件确定的基础上,将纤维素酶量调整为50、100、150、200、250 U/g,以1.2.4.1同样的方法对最佳蒸汽爆破预处理条件下的爆破物料进行酶解实验,测定酶解糖化率,确定其最佳纤维素酶量。

1.2.4.3 酶解糖化率的计算 参照1.2.2.1实验步骤及葡萄糖标准曲线方程:y=0.0082x+0.0283,,R2=0.9991,计算出酶解糖化液中可溶性糖浓度和全水解液中可溶性糖浓度,酶解糖化率计算公式如下:

式中:w-酶解糖化率,%;w1-酶解糖化液中可溶性糖浓度,μg/mL;w2-山楂果渣全水解液中可溶性糖浓度,μg/mL。

1.2.5 山楂果渣粉末微观结构表征 电镜(SEM)扫描:称取0.1 g不同蒸汽爆破预处条件下的山楂果渣粉末,固定在样品台上,然后喷金,再置于扫描电子显微镜中观察。

X射线衍射仪(XRD)扫描:取0.2 g不同蒸汽爆破预处条件下的山楂果渣粉末,置于X射线衍射仪所用的小平盘内,压平,扫描,根据Segal[14]公式计算相对结晶度。

式中:Cr-相对结晶度,%;I002-002面衍射峰的极大强度,cps;Iam-衍射角度2θ为18.5°时非结晶背景的散射强度。

1.3 数据分析

采用Origin 9.0对实验数据处理,用SPSS 20.0软件的最小显著差数法(LSD)多重比较方法进行显著性差异分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 蒸汽爆破预处理对山楂果渣组分的影响

由图1可知,随着蒸汽爆破预处理条件强度的增加，山楂果渣可溶性糖含量增多,可能是渗入其结构内部的蒸汽在瞬时降压时造成细胞壁结构被破坏使可溶性糖更易溶出,或者是蒸汽爆破预处理使得纤维素发生降解转变为可溶性糖[15-16];但在预处理条件2.4 MPa、4 min时,可溶性糖含量反而最少,主要是因为高强度的预处理条件使得可溶性糖大量损失无法收集。对于蒸汽爆破预处理对山楂果渣纤维素含量的影响无规律可寻,但总体来看预处理可以使纤维素结构被破坏发生降解使其含量降低,这样可以提高山楂果渣的利用率。

图1 蒸汽爆破预处理对山楂果渣纤维素、可溶性糖含量的影响Fig.1 Effect of steam explosion pretreatment on cellulose and soluble sugar content of hawthorn pomace

图2 蒸汽爆破预处理对山楂果渣总黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of steam explosion pretreatment on the extraction of total flavonoids from hawthorn pomace

由图2可知,与山楂果渣原物料相比,蒸汽爆破预处理后(除2.0 MPa、30 s外),总黄酮提取量显著增加(P<0.05),当预处理条件为2.4 MPa、4 min时,总黄酮提取量达到最大为26.5 mg/g,是原物料的1.5倍。黄酮主要存在于细胞内部,预处理后,山楂果渣的微观结构被破坏,导致细胞壁破裂,破坏了黄酮的天然保护屏障,这样更有利于黄酮的溶出与提取[17-18]。随着蒸汽爆破预处理时间的延长,总黄酮提取量呈不断增加的趋势,山楂果渣在蒸汽爆破压力2.0 MPa条件下,预处理时间30 s延长至4 min时,总黄酮提取量提高了12.4%;在压力2.4 MPa条件下,预处理时间30 s延长至4 min时,总黄酮提取量提高了25%,这主要是因为保压时间的延长使渗入山楂果渣结构内部的蒸汽增多,当瞬时降压时,对其完整的结构破坏更严重,细胞壁包裹的黄酮更容易溶出,这一趋势与张棋等[19]、张兵兵等[20]的研究结果基本类似。此外,蒸汽爆破的压力对山楂果渣的预处理效果也影响显著(P<0.05),高压使原物料微观结构破坏更严重,总黄酮提取量也相应地增加,在压力2.0、2.4 MPa条件下,同时预处理30 s时,压力2.4 MPa较2.0 MPa预处理条件下的山楂果渣总黄酮提取量提高了10.2%,这与电镜扫描微观结构的破坏程度基本相吻合。

2.2 蒸汽爆破预处理对山楂果渣酶解效果的影响

蒸汽爆破预处理使山楂果渣微观结构比表面积增加、颗粒尺寸减小,这样增加了纤维素酶与山楂果渣的接触面积,增大了酶与底物的结合能力,提高了酶的催化效率[21-22]。如图3所示，在蒸汽爆破压力为2.0 MPa条件下,预处理时间30 s延长至4 min时,山楂果渣微观结构的破坏程度增加,纤维素的相对结晶度降低,使得酶解糖化率提高了12.2%;在蒸汽爆破压力为2.4 MPa条件下,预处理时间30 s延长至2 min时,酶解糖化率提高了15.7%,但当预处理时间延长至4 min时,由于长时间高强度的蒸汽爆破预处理使山楂果渣纤维素的相对结晶度增加,此时酶解糖化率降到了21.6%,甚至较原物料的降低了0.244倍。当预处理条件为2.4 MPa、2 min时,酶解糖化率达到最大为39.0%,较原物料提高了0.302倍。综合考量,为了有利于后续山楂果渣糖化发酵高值化利用,所以选取蒸汽爆破预处理的最优条件为2.4 MPa、2 min。

图3 蒸汽爆破预处理对山楂果渣酶解糖化率的影响Fig.3 Effect of steam explosion pretreatment on enzymatic saccharification rate of hawthorn pomace

图4是蒸汽爆破2.4 MPa、2 min预处理条件下,添加不同纤维素酶量对山楂果渣酶解糖化率的影响。由图4可知,酶解糖化率随着纤维酶量的增加呈上升的趋势,此外,在酶解初期,纤维素酶最先酶解非结晶纤维,酶量对酶解糖化率差异影响不显著(P>0.05);但随着酶解时间的延长,结晶纤维开始酶解,酶量对酶解糖化率差异影响显著(P<0.05)。当酶量为50、100、150、200、250 U/g,酶解72 h时,酶解糖化率分别为33.4%、39.8%、42.0%、42.0%、42.0%。当酶量为200、250 U/g,酶解48 h时,酶解糖化率已经达到最大为42.0%,但当酶量为150 U/g,酶解糖化率达到42.0%时,酶解时间需要延长至72 h,本着高效、节约的原则,选择200 U/g为最适酶量,此条件下酶解糖化率较原物料提高了0.392倍。

图4 酶量对2.4 MPa、2 min预处理条件下山楂果渣酶解糖化率的影响Fig.4 Effect of enzyme quantity on enzymatic saccharification rate of hawthorn pomace under pretreatment conditions of 2.4 MPa and 2 min

2.3 蒸汽爆破预处理对山楂果渣微观结构的影响

图5中a～g为山楂果渣原料和不同蒸汽爆破预处理条件下的爆破物料的电镜扫描图(由于30 s爆破处理强度太小,微观结构不能充分体现与原物料的差别,所以选择1、2、4 min进行蒸汽爆破实验,X射线衍射同)。与山楂果渣原料相比较,蒸汽爆破预处理后,纤维素的微观结构遭到破坏。当压力为2.0 MPa蒸汽爆破预处理时间为1、2和4 min时,物料片层间结合松散,纤维之间结合明显变得松弛,部分纤维素断裂成碎片。当压力为2.4 MPa蒸汽爆破预处理时间为1、2和4 min时,从e、f、g图中可以看出,由于大量的蒸汽快速逸出使瞬时降压过程中物料结构发生破碎,破坏程度相对严重,表面裂纹增多,并出现大量小面积深沟甚至蜂窝状孔洞结构,物料无定形区的面积增加,表面也变得更加不均匀[18,23]。

2.4 X射线衍射(XRD)分析

图5 蒸汽爆破预处理条件下山楂果渣的电镜扫描图(800×)Fig.5 Scanning electron micrograph of hawthorn pomace under steam explosion pretreatment(800×)

由图6可知,山楂果渣经过蒸汽爆破预处理后,通过XRD图谱可以看出22.5 °的吸收峰较原物料明显变尖锐,利用Segal经验公式求得原物料和蒸汽爆破预处理后山楂果渣纤维素的相对结晶度如表1所示。除预处理条件为2.4 MPa、4 min时,纤维素相对结晶度增加外,其它预处理条件下的纤维素相对结晶度较原物料均减小,蒸汽爆破使纤维素的结构破坏,从而散射的X射线强度减弱。其中山楂果渣经过2.4 MPa、2 min预处理后的纤维素相对结晶度降低最多,减少了0.257倍,相应地增加了其微观结构的比表面积,这样可以使酶解糖化率相对提高。但在预处理条件为2.4 MPa、4 min时,纤维素相对结晶度提高了0.279倍,可能是因为高强度的预处理条件引起了纤维素氢键重排和重结晶,结晶区面积增加,或者是非结晶纤维发生了降解,非结晶区减少,这与酶解糖化实验结果一致[24-25]。

表1 不同预处理条件下山楂果渣在X射线衍射(XRD)图谱的相对结晶度Table1 Relative crystallinity of hawthorn pomace under X-ray diffraction(XRD)spectra under different pretreatment conditions

图6 蒸汽爆破预处理条件下山楂果渣X射线衍射(XRD)图谱Fig.6 X-ray diffraction(XRD)pattern of hawthorn pomace under steam explosion pretreatmen

3 结论

山楂果渣经蒸汽爆破预处理后,使其微观结构遭到破坏,其组分也发生了相应的变化,总体来看蒸汽爆破预处理使山楂果渣的可溶性糖含量增加,纤维素含量减少;同时随着预处理条件强度的增加总黄酮提取量也相对增加,在预处理条件为2.4 MPa、4 min时,总黄酮提取量达到最大为26.5 mg/g,是原物料的1.5倍。

为了实现后续山楂果渣糖化发酵高值化利用,以酶解糖化率为蒸汽爆破预处理最佳条件的衡量标准,根据酶解糖化实验结果,得出在预处理条件2.4 MPa、2 min,纤维素酶量为200 U/g时,酶解效果最佳,酶解糖化率为42.0%,较原物料提高了0.392倍;电镜扫描显示,山楂果渣蒸汽爆破之前,纤维结构较为致密,表面碎片较少,经爆破处理后,出现大批量的裂纹、碎片和蜂窝状孔洞结构,物料无定形区的面积增多;X射线衍射分析表明,蒸汽爆破预处理使山楂果渣的大部分纤维素相对结晶度降低。

通过蒸汽爆破预处理,山楂果渣可开发利用的组分增加、酶解糖率提高,且效果明显,可为后续开发利用提供理论指导和技术支持。