响应面法优化大黄鱼鱼卵油的酶法提取工艺

,2,2,2,*

(1.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002;2.福建农林大学海洋研究院,福建福州 350002)

大黄鱼(Pseudosciaenacrocea),又名大王鱼、黄花鱼、石头鱼,是中国重要的海水养殖鱼类之一,其产量居海洋网箱养殖第一位,《2018中国渔业统计年鉴》中关于海水养殖鱼类的统计数据显示,大黄鱼的养殖产量可达17.76万吨,在我国渔业经济中占据了重要地位[1]。它主要分布于中国东部和南部沿海水域,因其良好的口感和高营养价值而受到许多消费者的青睐[2-3]。

鱼卵作为鱼类的主要加工副产物,可加工的产品形式单一,高品质的鱼卵可被加工成鱼子酱[4],而其它一些鱼卵通常未能有效利用,如大黄鱼鱼卵因其颗粒细,腥味重,在加工过程中经常被当做废弃物处理,造成很大程度上的资源浪费[5]。研究表明鱼卵油是长链n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)的主要来源之一,主要包括二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)[6],它在促进人体健康、降低发炎反应、调节血脂和降低血管疾病发病率方面发挥了重要作用[7],但其富含的n-3PUFA在人体内不能合成,需要从外界摄入[8]。为进一步拓宽海洋鱼油的来源,可以考虑将大黄鱼鱼卵作为原料提取鱼油,但目前国内外对大黄鱼鱼卵油提取工艺方面的研究鲜见报道。

目前,鱼油的提取方法主要有蒸煮法、淡碱水解法、酶解法、超临界流体萃取法和试剂法等[9]。其中,酶解法条件温和、易于控制,且所得油脂提取率高、品质好,近年来受到广泛应用[10]。郝淑贤[11]等比较不同提取方法对鱼油提取质量的影响,发现酶解法提取所得鱼油量最多,提取率为79.44%,明显高于钾法、氨法和蒸煮法。许艳萍[12]等前期采用胰蛋白酶提取大黄鱼内脏鱼油,效果显著,但对于酶解法提取大黄鱼鱼卵油的工艺尚未研究,故本研究在比较几种酶对大黄鱼鱼卵油提取效果的基础上,筛选出最佳的蛋白酶,并进一步通过响应面法优化最优酶对大黄鱼鱼卵油的提取工艺,以期为大黄鱼鱼卵资源综合利用提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大黄鱼鱼卵 购买于福建宇辉食品实业有限公司;木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶 北京Solarbio公司;氢氧化钠、盐酸、石油醚 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

HJ-4A恒温磁力加热搅拌器 江苏金坛市宏华仪器厂;ST2100实验室pH计 奥豪斯仪器(常州)有限公司;DK-S24型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司;DL-5-B型离心机 上海安亭科学仪器厂;DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大黄鱼鱼卵油提取工艺流程 原料→调节液固比→搅拌→调pH→加酶→酶解→高温灭酶→冷却→离心(室温)→分离→鱼卵油[11]。

操作步骤:将新鲜大黄鱼鱼卵解冻后,称取一定量放入烧杯中,按比例加水调节液固比(mL/g),待溶液搅拌均匀后,再用4 mol/L的NaOH溶液调至最佳pH,加入适宜量的蛋白酶在一定的温度条件下酶解,酶解一段时间后90 ℃灭酶5 min,冷却后分装,在5000 r/min下离心20 min,分离出上层鱼卵油。

1.2.2 蛋白酶的选择 选取六种蛋白酶,分别在各自的建议酶解条件下对大黄鱼鱼卵进行酶解,具体见表1。其它条件保持一致,液固比2∶1 (mL/g),酶解时间3 h,酶添加量2%(以原料质量为基准),离心条件为5000 r/min,20 min。以鱼卵油提取率为评价指标,选取提取效果最优的蛋白酶进行后续试验。

表1 不同蛋白酶酶解条件对照表Table 1 Comparison table of enzymatic hydrolysis conditions of different proteases

1.2.3 单因素实验 以碱性蛋白酶为大黄鱼鱼卵提取鱼油最优酶,其它条件保持一致,分别研究温度、时间、pH、酶添加量、液固比对鱼卵油提取率的影响。

1.2.3.1 酶解温度对鱼卵油提取率的影响 在液固比2.5∶1 (mL/g)、pH10、酶添加量2%,酶解时间3 h的条件下,分别取酶解温度40、45、50、55、60 ℃,探究不同酶解温度对鱼卵油提取率的影响,从而确定最佳的酶解温度。

1.2.3.2 酶解时间对鱼卵油提取率的影响 在液固比2.5∶1 (mL/g)、pH10、酶添加量2%,酶解温度55 ℃的条件下,分别取酶解时间1、1.5、2、2.5、3 h,探究不同酶解时间对鱼卵油提取率的影响,从而确定最佳的酶解时间。

1.2.3.3 初始pH对鱼卵油提取率的影响 在液固比2.5∶1 (mL/g)、酶添加量2%、酶解温度55 ℃、酶解时间2 h的条件下,调节pH为9、10、11、12、13,考察pH对鱼卵油提取率的影响,从而确定最佳的pH。

1.2.3.4 酶添加量对鱼卵油提取率的影响 在液固比2.5∶1 (mL/g)、酶解温度55 ℃、酶解时间2 h,pH12的条件下,考察酶添加量分别为1%、2%、3%、4%、5%时对鱼卵油提取率的影响,从而确定最佳的酶添加量。

1.2.3.5 液固比对鱼卵油提取率的影响 在酶解温度55 ℃、酶解时间2 h,pH12,酶添加量2%的条件下,考察液固比分别为2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1、3.5∶1、4.0∶1 (mL/g)时对鱼卵油提取率的影响,从而确定最佳的液固比。

1.2.4 响应面试验 根据响应面试验设计原理,在单因素实验结果的基础上,选择酶解温度、酶解时间和初始pH作为研究因素,并以提取率为响应值,进行三因素三水平的响应面设计与分析,试验因素及水平设计如表2所示。

表2 响应面试验因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 大黄鱼鱼卵中脂肪的测定 按照《GB 5009.6-2016食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中索氏抽提法进行测定。

1.2.6 鱼卵油提取率的计算

1.3 数据统计与分析

所有试验均平行测定3次,采用SPSS 20.0软件对数据进行Duncan检验,多重比较得差异显著性分析结果(P<0.05);采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析;采用Origin 9.0软件作图,数据以“平均值±标准差”显示。

2 结果与分析

2.1 脂肪含量

通过试验测定,结果显示新鲜大黄鱼鱼卵中的脂肪含量为12.2%。

2.2 蛋白酶的选择

由图1可知,不同蛋白酶的提取率之间差异性显著。复合蛋白酶的提取率最低,仅有32.62%,其次是胰蛋白酶43.39%,木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶三者较接近,分别为50.95%、54.88%与59.08%,而碱性蛋白酶的提取效果最好,提取率可达61.76%,约为复合蛋白酶提取效果的2倍。Gbogouri[13]等以新鲜鲑鱼头为原料,利用碱性蛋白酶对其进行酶解,鱼油提取率为19.8%;Al-Sayed-Mahmoud[14]等用多种蛋白酶水解虹鳟鱼鱼籽,结果发现在碱性蛋白酶的作用下,鱼油提取率为38.5%,相对最高;白冬[15]选用碱性蛋白酶作为实验用酶,对鲣鱼内脏进行酶解,鱼油提取率高达57.76%。

图1 不同蛋白酶对鱼卵油提取率的影响Fig.1 Effect of different proteases on extraction rate of fish roe oil注:不同小写字母代表有显著性差异(P<0.05)；图2～图6同。

碱性蛋白酶是由培育的地衣芽孢杆菌发酵而得,主要成分为枯草杆菌蛋白酶,是一种内肽酶,它最适pH范围内的取值大于其余五种蛋白酶,表明大黄鱼鱼卵在碱性较强的环境中容易分离出油脂,因此本研究均采用碱性蛋白酶作为提取鱼卵油工艺的最优酶。

2.3 单因素实验

2.3.1 酶解温度对鱼卵油提取率的影响 由图2可知,随着温度的升高,鱼卵油提取率先呈现上升趋势,在55 ℃的时候达到最高,紧接着又出现下降趋势。由于升温可以增加分子间动能和促进分子扩散,有利于油脂的溶出,而温度过高又会破坏酶的活性,使蛋白酶变性失活,酶解能力下降,鱼油提取率也相应地降低[16]。所以,选用55 ℃作为最适温度。

图2 酶解温度对鱼卵油提取率的影响Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of fish roe oil

2.3.2 酶解时间对鱼卵油提取率的影响 由图3可知,在2 h之前,随着时间的延长,鱼卵油提取率不断增加,2 h时提取效果最好,2 h以后提取率反而下降。这是由于时间过短,酶与底物的结合不够充分,不能彻底释放出油脂,而鱼卵油属于海洋鱼油,富含不饱和脂肪酸(UFA),酶解时间过久又会致使鱼油氧化分解,不饱和脂肪酸总量呈降低趋势,同时,时间的延长也会导致酶活力的下降,所以鱼油提取率降低,鱼油品质也随之变差[12]。故选2 h为最佳酶解时间。

图3 酶解时间对鱼卵油提取率的影响Fig.3 Effect of enzymolysis time on extraction rate of fish roe oil

2.3.3 初始pH对鱼卵油提取率的影响 从图4可以看出,在pH9.0～13.0的范围内,提取率随着pH的增加出现先上升后下降的趋势,当pH为12.0时,酶解效果最好。碱性蛋白酶在一定条件下有其最适合的pH取值范围,pH的不同导致酶活力不同,进而出现鱼卵油提取率高低不一的结果。酶的最适pH也不是固定不变的,它受很多外在因素的影响,会因底物的不同和溶液浓度的差异而发生改变[17]。pH较小时,鱼卵油提取率较低,分析原因可能是底物没有完全酶解,增强碱性至该环境下碱性蛋白酶的最适pH,可使酶活增加,促进其水解,释放更多油脂分子,但是pH过高时,反应体系中会发生油脂的皂化反应,从而导致提取率的下降[18]。故选定pH12进行后续实验。

图4 初始pH对鱼卵油提取率的影响Fig.4 Effect of initial pH on extraction rate of fish roe oil

2.3.4 酶添加量对鱼卵油提取率的影响 从图5可以看出,提取率随酶量的增加基本呈不断上升的趋势,酶添加量1%～3%时上升缓慢,3%以后上升加快。虽然酶加量2%与3%之间的差异性不显著,但这两组与其他三组1%、4%、5%相比较,差异显著(P<0.05)。可能是酶加量较少时,单位体积内与底物接触的蛋白酶较少,酶解不充分,随着酶量的增加,原料与接触的机会越来越多,反应加快,促使油脂从底物中分离出来,提高提取率。但是考虑到在实验过程中,酶加量4%以后油脂的分离较难及蛋白酶购买成本较高,最终选取4%为蛋白酶最佳添加量。

图5 酶添加量对鱼卵油提取率的影响Fig.5 Effect of enzyme dosage on extraction rate of fish roe oil

2.3.5 液固比对鱼卵油提取率的影响 从图6可知,液固比对鱼卵油提取率的影响不显著。液固比2.0∶1～2.5∶1之间鱼卵油提取率略微有所上升,2.5∶1以后呈缓慢的下降趋势。液固比较小时,溶液浓度较大,过于黏稠,酶与底物接触不均匀,酶解反应不能充分进行,故鱼卵油提取率较低。液固比过大,体系内含水量的增加会致使底物和酶浓度偏低,影响酶解反应速率,导致提取结果变差,另外,提高液固比也不利于后期鱼卵油的分离。综上所述,选2.5:1(mL/g)为最佳液固比。

图6 液固比对鱼卵油提取率的影响Fig.6 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of fish roe oil

2.4 响应面法优化大黄鱼鱼卵油的提取工艺

2.4.1 试验设计方案及结果 根据表2选定的响应面考察因素和水平,通过Box-Behnken方法设计得到17组试验,具体方案及结果见表3。

表3 响应面试验设计方案及结果Table 3 Experiment design and results of response surface methodology

2.4.2 模型建立与方差分析 利用Design-Expert 8.0.6软件对表3数据进行分析,得到鱼卵油提取率与各因素之间的二次多元回归拟合方程为:

Y=80.45+2.60A-0.34B+7.78C+3.31AB+4.56AC+1.28BC-5.01A2-8.26B2-5.48C2

由表4可知,P<0.0001,表明该二次多项模型显著性极好,试验方法可靠;决定系数R2=0.9904,说明回归方差模型拟合度较好,因为R2越接近于1,该模型就越能更好地体现出试验结果;Adeq Precision(精密度)=27.424>4,表明模型可用,足以拟合试验结果;CV(变异系数)=1.83%<10%,则说明试验具有较好的稳定性,结果精确可靠。在该方差分析中,F值体现各单因素对鱼卵油提取率影响的大小,F值越大,提取效果越好,从表中可以看出C>A>B,即对鱼卵油提取率的影响,初始pH>酶解温度>酶解时间。

2.4.3 响应面分析 响应面法有着正交试验所不具备的特点,它可以给出直观的图形,考察两个因素之间的交互作用对鱼卵油提取率的影响[19]。等高线图的形状为圆形时,表示两因素之间的交互作用不显著;当它为椭圆或鞍马形时,表示两者交互作用显著。另外,响应面图中曲面的陡峭程度能直观反映单因素对响应值提取率影响的大小[20]。

表4 二次响应面回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic respoase surface regression model

注:**差异极显著(P<0.01);*差异显著(P<0.05)。在图7中,交互作用项酶解时间和酶解温度的等高线呈椭圆形,说明两者交互作用显著。从响应曲面图可以看出,在B(时间)为2 h的水平和A(温度)为55 ℃的水平上,提取效果最好。表明提取率随酶解时间和酶解温度的增加而增加,时间过长或者温度过高反而会造成提取率的下降。

图7 酶解温度和酶解时间对提取率影响的响应面图及等高线图Fig.7 Response surface plots and contour plots showing the effects of enzymolysis temperature,enzymolysis time on extraction rate

图8 初始pH和酶解温度对提取率影响的响应面图及等高线图Fig.8 Response surface plots and contour plots showing the effects of initial pH,enzymolysis temperature on extraction rate

在图8中,交互作用的等高线为椭圆形,表明交互作用项酶解pH和酶解温度间的交互作用显著。由等高线图可以看出,最高的提取率对应的温度范围为56～58 ℃、pH范围为11.5～12,则表示这两个范围对提取率的影响显著。在响应曲面图中,A(酶解温度)为56 ℃的水平和C(酶解pH)为12的水平提取效果最佳,说明在选定的温度范围内,随温度的上升,提取率先增加后降低;而在选定的pH范围内,随pH的加大,提取率不断上升。

在图9中,等高线呈圆形,表明酶解时间和酶解pH之间的交互作用不显著。由响应曲面图可以看出,在因素C(酶解pH)为12的水平和因素B(酶解时间)为2 h的水平下鱼卵油提取率最高,随着设定范围内pH的增加,提取率一直呈上升趋势,而随着酶解时间的延长,提取率先升高,2 h时效果最佳,以后则出现下降趋势。

图9 初始pH和酶解时间对提取率影响的响应面图及等高线图Fig.9 Response surface plots and contour plots showing the effects of initial pH,enzymolysis time on extraction rate

2.4.4 验证试验 经响应面试验,最终优化出的工艺参数为:温度58.92 ℃、时间2.11 h、pH12.00,此条件下鱼卵油提取率的预测值为85.65%。考虑到实际情况,将上述最佳条件调整为温度58.9 ℃、时间2.1 h、pH12.0,并按照此条件进行3次重复性实验,得到的提取率为86.29%±0.04%,与回归方程理论鱼卵油提取率85.65%±0.02%非常接近。因此,该响应面试验可行性良好,优化出的工艺条件可靠、有效。

3 结论

通过采用响应面法优化大黄鱼鱼卵油的酶法提取工艺,以大黄鱼中鱼卵油的提取率为响应值进行响应面分析,结果表明,对鱼卵油提取率的影响,初始pH>酶解温度>酶解时间;优化出的最佳工艺参数为:温度58.9 ℃、时间2.1 h、pH12.0,此条件下得到的鱼卵油提取率为86.29%±0.04%,与预测值十分接近,方法可靠。由此可见,该工艺条件的建立可为利用大黄鱼鱼卵开发鱼卵油奠定基础,也为本课题的后续深入研究提供了理论依据和参考数据。