高产γ-氨基丁酸的双歧杆菌的筛选及对抑郁细胞模型的改善作用

,3,4,*

(1.深圳市华大生命科学研究院,广东深圳 518083;2.深圳华大农业应用研究院,广东深圳 518120;3.农业部农业基因组学重点实验室,广东深圳 518083 4.深圳市环境微生物基因组学与应用重点实验室,广东深圳 518083)

抑郁症是一种表现为自卑、快感缺乏,且伴随着较高致残率和致死率的疾病[1-3]。由于其发病机制复杂,较难治愈,因此引起了人们的广泛关注。目前,该疾病主要采用三环类抗抑郁剂(TCAs)、单胺氧化酶抑制剂(MAOI)等药物治疗。但药物通常有一定的副作用,如:抑制肠道微生物的生长[4],口干、便秘、视物模糊等。因此,新型、高效且无毒的治疗方式是目前研究的重点。

最新研究发现,部分益生菌具有改善抑郁症的作用。如Desbonnet等[5]发现抑郁症模型大鼠喂饲婴儿双歧杆菌后,大鼠表现出抗抑郁能力。抑郁患者服用瑞士乳杆菌R0052和长双歧杆菌R0175混合益生菌制剂后,其抑郁症状得到显著改善[6]。γ-氨基丁酸是由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)催化L-谷氨酸的α-羧基脱羧反应生成的一种非蛋白质氨基酸,其作为一种重要的神经传导物质抑制剂,不仅能抑制神经传递、降血压、降血糖,而且有镇定剂效果[7-11]。近年来,高产GABA乳酸菌的筛选和研究颇多[11-14]。梁金钟等[15]体外筛选出一株产GABA的植物乳杆菌Lp-Lw-131,其GABA的产量为0.917 g/L;同样,产GABA的布氏乳杆菌MS可以保护由化学物质诱导的神经细胞死亡[16]。本文主要以胆盐水解酶活性、耐酸耐胆盐能力、抗生素耐受性、粘附能力以及GABA的产力及干预抑郁细胞模型作用对双歧杆菌的功能特性进行研究,以期筛选出具有潜在抗抑郁作用的菌株。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

94株双歧杆菌 均由深圳华大基因益生菌与发酵实验室提供,试验中重点研究的13株双歧杆菌详细信息见表1;BS培养基 海博生物;细胞培养板 AXYGEN;细胞培养皿 FALCON;PRMI 1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、CCK 8、PBS Gibco;皮质酮(Corticosterone,CORT) GmbH;HT-29(人结肠癌细胞)、SH-SY5Y(人类神经母细胞瘤株) 北纳生物;庆大霉素、链霉素、卡那霉素、新霉素、氨苄青霉素、四环素、红霉素、克林霉素、氯霉素、甲氧苄啶、环丙沙星、利福平、万古霉素 美国BBI;甘氨酸 上海生工生物工程技术服务有限公司。

表1 13株双歧杆菌菌株信息Table 1 Information of 13 Bifidobacteriums strains in experiment

立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司;生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司;FP-1100-C型全自动生长曲线仪 Bioscreen;5424R型台式冷冻离心机 Eppendorf;UV-6100型紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司;CO2培养箱Galaxy170R Eppendorf;酶标仪Synergy 2 BioTek;LC-2030型液相色谱仪 日本岛津仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 产BSH双歧杆菌的筛选

1.2.1.1 标准曲线绘制 采用茚三酮比色法[17]测定氨基酸含量;以在570 nm测定浓度为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L甘氨酸溶液的吸光度,以绘制标准曲线。

1.2.1.2 BSH活力测定 双歧杆菌培养液在4 ℃经10000×g离心10 min倒上清后生理盐水洗脱2次,随后调制成1×109CFU/mL的菌液。在15 mL锥形反应管中加4 mL 5 mmol/L甘氨去氧胆酸钠(GDCA)缓冲液、1 mL的菌液混匀后,37 ℃水浴30 min,在570 nm读取吸光值。BSH酶活(U)定义为1×109CFU/mL菌液经过1 min反应产生甘氨酸的物质量(μmol)[17]。

1.2.2 菌株抗生素敏感性 采用最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)法,测试试验菌株的耐药情况,其中以标准菌株干酪乳杆菌(Lactobacilluscaseisubsp ATCC334)作为阳性质控。参照WHO提供的NCCLS标准[18],确定双歧杆菌对各抗生素的敏感性。

将13种抗生素分别作一系列2倍比稀释,得到浓度分别为0.03125～1024 μg/mL的抗生素溶液。将不同浓度的抗生素溶液加入96孔板中,随后加入50 μL浓度为109CFU/mL双歧杆菌菌液,37 ℃培养48 h,观察实验结果。

1.2.3 耐酸、耐胆盐能力检测 将初筛得到BSH活性较高的13株双歧杆菌以3%接种量接种于BS液体培养基中,菌株培养至稳定期后4 ℃下6000 r/min离心10 min收集菌体,PBS(pH7.2)洗涤2次,重悬于pH2和pH3的无菌PBS缓冲液中,并将细菌浓度调至109CFU/mL。37 ℃培养2 h后,取样涂板计数,并计算存活率[19]。

13株双歧杆菌分别以3%接种量接种于BS(含有0.3%胆盐)液体培养基中,37 ℃条件下连续培养,分别在3 h和6 h取样涂板计数,并计算存活率。

1.2.4 粘附性试验 参考Gagnon等的方法[20],将HT-29细胞以每孔1×105的接种量接种于12孔板中,每孔含2 mL PMI 1640完全培养基(10% FBS)。收集培养至稳定期的双歧杆菌菌体(4 ℃,6000 r/min,10 min),并用PBS洗涤3次,然后用细胞培养液将其重悬至5×108CFU/mL。待细胞长至单层,去除细胞培养液,并用无菌PBS冲洗细胞2～3次,然后加入1 mL双歧杆菌悬浮液(每株菌3个重复)。37 ℃ 5% CO2-95%空气培养箱中培养2 h后,弃除细菌悬浮液,PBS冲洗3～5次,胰蛋白酶消化3 min,加入适量含有10% FBS的1640培养液终止反应。然后,加入1 mL 0.05% TritonX-100,反复吹打使细胞完全裂解,收集菌体并进行系列稀释,涂板计数。另选取长至单层的培养孔,进行细胞计数并计算其粘附能力。

1.2.5 HPLC法筛选GABA高产菌株 参照Wu等[21]的方法,双歧杆菌发酵液12000 r/min离心10 min后,取上清液100 μL,加入20 μL衍生试剂、100 μL硼酸缓冲液混合均匀,室温反应5 min后高效液相色谱检测GABA。流动相A为20 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH7.3),流动相B为乙腈,其比例为4∶1。衍生试剂:OPA 20 mg、β-巯基乙醇20 μL及5 mL乙腈,混匀。硼酸缓冲液:硼酸24.7 g,加超纯水定容至1 L,pH为10.4。进样量:20 μL,流速:0.8 mL/min,柱温:30 ℃,360 nm处检测吸收峰,外标法定量。

1.2.6 双歧杆菌对抑郁症细胞模型干预实验 以每孔5×104的接种量,将状态良好的SH-SY5Y细胞接种于每孔含200 μL RPMI 1640完全培养基(10% FBS)的96孔板中,培养至细胞铺满底部60%～80%。分别设置空白对照组(CON)、模型组(Model)及4个双歧杆菌组,每组3个重复。除空白对照组外,其余各组参考Li等[22]的方法均采用300 μmol/L的CORT刺激SH-SY5Y细胞,37 ℃作用24 h。抑郁细胞模型诱导成功后,分别用107、106、105CFU三个剂量的双歧杆菌干预抑郁模型细胞,37 ℃干预4 h。最后,采用CCK 8法检测细胞活性,A450 nm波长处测定其光吸收值。

1.3 数据处理

每个试验重复3次,选用SPSS(Version 22.0)软件对试验结果进行单因素Duncan法差异统计分析,P<0.05为显著差异。数据以平均值±标准差表示,使用GraphPad prism 7软件作图。

2 结果与分析

2.1 菌株产BSH菌株的能力

BSH活性定量结果显示,13株双歧杆菌表现出较高的BSH活性,BSH活性范围为:0.027～4.99 U/mL(图1)。其中,双歧杆菌98的BSH活性最高,为4.99 U/mL,显著高于其他菌株(P<0.05)。而双歧杆菌ZT3活性最低,为0.027 U/mL。随后选取此13株双歧杆菌进行下一步研究。

图1 双歧杆菌BSH活性Fig.1 Bile salt hydrolase activity of Bifidobacterium strains注:不同字母代表差异显著,P<0.05,图3同。

2.2 菌株的抗生素耐性

由表1可知,13株双歧杆菌对氨基糖苷类抗生素均具有耐受性。除此之外,双歧杆菌95、115和126对其他抗生素均敏感,双歧杆菌ZT3、84和105耐1种抗生素,双歧杆菌98、106、108和154分别耐2种抗生素,而双歧杆菌90、91和92可耐3种抗生素。邱宏瑞[23]等研究也发现:双歧杆菌对红霉素、四环素较为敏感,而对氨基糖苷类(庆大霉素、链霉素、卡那霉素)不敏感,这与本研究结果一致。

2.3 菌株的耐酸、耐胆盐能力

通过计算酸化2 h前后的活菌数得知,13株双歧杆菌均能在pH3的环境中存活,其中,双歧杆菌ZT3、95、105、126、154和84的存活率相对较高,分别是86.3%、85.2%、71.4%、68.9%、67.1%和65.5%。但当pH降至2.0时,其生长受到明显抑制,仅有ZT3(2.2%)、84(8.8%)和105(3.5%)三株菌有较低的存活率(图2),三组之间差异显著(P<0.05)。推测双歧杆菌对pH2的酸性环境所产生的应激反应不足以消除酸胁迫带来的不利作用。

高浓度的胆盐对外源益生菌具有一定的杀灭能力,从图2可以看出,在含0.3%胆盐的培养基中培养3 h后,95、84和ZT3三株双歧杆菌的存活率相对较高,分别为86.6%、72.7%和63.5%,三组之间差异显著(P<0.05)。但培养时间延长至6 h时,大部分双歧杆菌的生长受到明显抑制,仅有双歧杆菌84和ZT3具有较高的存活率,分别为65.8%和52.0%。这可能是因为随着胆盐处理时间的延长,其他双歧杆菌细胞质溶解、膜内蛋白流出,进而导致菌体细胞的死亡[24],而动物双歧杆菌的环境胁迫耐受能力高于其他双歧杆菌。

表1 各株双歧杆菌的药敏试验结果Table 1 Antibiotic resistance results of Bifidobacterium strains

图2 双歧杆菌对pH2.0和pH3.0的酸耐受性Fig.2 Effect of pH2.0 and pH3.0 on viability of different probiotics

注:加粗的数值表示该菌的MIC超过NCCLS规定的最低浓度。

2.4 菌株的粘附能力

由图3可知,双歧杆菌92的粘附能力最强,平均每个细胞粘附33.77 CFU/cell,显著高于剩余菌株(P<0.05);其次是双歧杆菌95,平均每个细胞粘附活菌数为23.23 CFU/cell;双歧杆菌98和91的粘附能力也较强,分别为20.46和19.34 CFU/Cell。说明双歧杆菌92、95、98和91在肠道具有较强的定植能力。不同菌株定植于肠道上皮细胞的能力不同,这可能与菌株表面存在的与粘附相关的物质(粘附素、脂磷壁酸等)有关。

图3 不同双歧杆菌粘附能力结果Fig.3 Ability of adhering by different probiotics

2.5 菌株产GABA的能力

为探究13株双歧杆菌产GABA的能力,本试验选用高效液相色谱法定量分析。由图4可知,与对照组相比,双歧杆菌98和95 GABA的产量显著提高(P<0.05)。其中,双歧杆菌98产GABA的能力最强,平均产量可达285.0 mg/L,其次是双歧杆菌95,平均产量为232.8 mg/L。其余菌株的GABA产量相对较低,相比于对照组无显著差异(P>0.05)。李理等[25]研究发现:植物乳杆菌NDC75017也可产生GABA,这与本研究结果一致,并推测合成GABA除受GAD及gadB基因影响,其他的合成支路相关酶以及基因也参与其中。

图4 不同双歧杆菌产GABA能力结果Fig.4 Ability of producing GABA by different probiotics注:***代表与对照组(Control)差异显著,P<0.05。

2.6 菌株对抑郁症细胞模型干预能力

由图5可知,相比于对照组,模型组的细胞活性显著降低(P<0.05)。其中,高、中、低3个剂量的双歧杆菌98均能显著缓解CORT诱导的细胞损伤(P<0.05);而双歧杆菌95对缓解细胞损伤具有剂量依赖性,仅在高剂量下才有显著效果(P<0.05)。上述GABA实验证实双歧杆菌95的GABA产量低于98,而中、低剂量的双歧杆菌95未能缓解CORT诱导的细胞损伤,这可能与菌体浓度太低导致GABA合成量不足有关。

综上所述,缓解CORT诱导的抑郁细胞活性存在菌株和剂量特异性,高剂量的双歧杆菌98、95及中、低剂量的双歧杆菌98具有缓解CORT诱导的细胞损伤的作用。

图5 不同双歧杆菌缓解抑郁的效果Fig.5 Antidepressive-like effect of different Bifidobacterium注:CON表示空白对照组;Model表示CORT诱导的抑郁细胞模型组;M+107表示抑郁细胞模型添加107 CFU益生菌组;M+106表示抑郁模型细胞添加106 CFU益生菌组;M+105表示抑郁模型细胞添加105 CFU益生菌组。*代表与CON组差异显著,P<0.05;#代表与Model组差异显著,P<0.05;##代表与Model组差异极显著,P<0.01。

3 讨论

双歧杆菌作为潜在的功能菌株必须要通过抗生素安全性评价。本实验结果显示,13株双歧杆菌均对氨基糖苷类抗生素耐药。邱宏瑞[23]等研究也发现:双歧杆菌对氨基糖苷类(庆大霉素、链霉素、卡那霉素)不敏感,这与本研究结果一致。这可能是因为氨基糖苷类抗生素发挥其作用需要氧气的参与,而双歧杆菌是厌氧菌,因此普遍表现出对氨基糖苷类抗生素不敏感。

人体胃酸pH在2.0～3.0之间,小肠中胆盐浓度在0.03%～0.3%之间,而食品在小肠停留的时间一般为1～4 h。因此,益生菌能够耐酸耐胆盐成为其发挥有益作用的必要条件之一。有研究发现9株双歧杆菌在pH3酸性条件下的存活率皆高于95%[26],这高于本研究菌株的最高耐酸能力(86.6%),除环境应激反应外,菌株耐酸能力还可能与H+-ATP酶活性有关[27]。本实验中13株双歧杆菌都表现出胆盐耐受性,这与朱宗涛等[19]研究一致。而乳酸菌的耐胆盐机制与其本身的胆盐水解酶和表面蛋白有关[28]。HT-29细胞粘附性试验显示,各菌株间的粘附能力有明显差异,其中双歧杆菌91、92、95和98表现出较强的粘附能力。本数据与李平兰[29]等的研究结果类似,其研究发现双歧杆菌的平均粘附能力为10.5 CFU/Cell。研究发现菌株S层表面蛋白或者脂磷壁酸在菌株的粘附过程中发挥重要作用[30-31],因此,本实验菌株的粘附能力可能其S层表面蛋白、黏附素或者脂磷壁酸有关。

GABA是中枢神经系统中的神经递质,其可在人体内产生抗应激作用,并与抑郁症的改善有关。本文将13株双歧杆菌在mMRS(3%谷氨酸钠+0.05% L-半胱氨酸盐酸盐)培养基中37 ℃培养36 h后,筛选出2株高产GABA的双歧杆菌98和95,产量分别为285.0、232.8 mg/L,而刘韩等[32]研究发现:长双歧杆菌QYW-B-11在MRS(1%谷氨酸)培养基中37 ℃培养72 h后,GABA产量为60 mg/L,这低于本研究中菌株GABA产量,这可能与其培养基MRS中含1%谷氨酸的有关。人类神经母细胞瘤株是一种分化程度较低的肿瘤细胞,其生理生化功能与正常神经细胞相似[33]。而皮质酮可以通过损伤人类神经母细胞瘤株来模拟抑郁症神经细胞的损伤状态。由抑郁细胞模型试验结果可知,双歧杆菌98和95均能显著提高CORT诱导的抑郁模型细胞的活性,与Li等[22]的结果类似,其证明了巴戟天中的活性寡糖菊粉对CORT诱导的细胞有明显的保护作用。Cho等[16]研究发现:产GABA的布氏乳杆菌MS可以保护由化学物质诱导的神经细胞死亡。Strandwitz等[34]等试验表明,高产GABA的Bacteroides与抑郁症状呈负相关。因此,高产GABA的益生菌在抑郁症的治疗中发挥着不可或缺的作用。

4 结论

本研究筛选出的青春双歧杆菌95和98具有高产γ-氨基丁酸的能力,γ-氨基丁酸产量分别为285.0 mg/L和232.8 mg/L。抑郁细胞模型干预试验初步证明:双歧杆菌95和98均具有缓解抑郁模型细胞活性的功效,高、中、低剂量高产GABA的双歧杆菌98都具有缓解CORT诱导的细胞损伤的能力,而双歧杆菌95对缓解细胞损伤具有剂量依赖性，且只有在高剂量组下才有显著效果(P<0.05)。