血清miR-124、miR-143水平与高血压性视网膜病变关系的研究

韩月圣，焦瑞雪，张爱雪，崔迎欣，张乘瑞

高血压性视网膜病变(hypertensive retinopathy，HRP)是由动脉血压升高，引发全身小动脉硬化，进而造成视盘水肿、视网膜水肿、渗出等各种临床症状，且具有较高病变率特点的眼科疾病，对患者日常生活及工作造成不良影响[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类在外周血中广泛存在的高度保守的小分子RNA，其在多种疾病发生发展过程中表达异常，可作为疾病诊断的潜在临床指标[2]。患者发生高血压后，外周血miRNA水平会发生改变，患者长期处于高血压状态，可引起视网膜病变[3]。Matsuoka等[4]研究显示，微小RNA-124(microRNA-124，miR-124)在脑卒中倾向的自发性高血压中呈低表达，可通过影响紧密连接蛋白CLDND1水平，进而参与疾病的发生与发展。微小RNA-143(microRNA-143，miR-143)在原发性高血压患者外周血白细胞中表达上调，较高的miR-143水平为原发性高血压的危险因素，其可能与原发性高血压的发病进程有关[5]。但miR-124、miR-143在HRP患者血清中的表达情况及与HRP的关系尚未见相关研究报道。基于此，现观察miR-124、miR-143在HRP患者血清中的相对表达水平，以期为HRP早期诊疗提供可靠临床依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年3月—2019年6月中国核工业北京四○一医院眼科诊治HRP患者113例为研究对象(HRP组)，男57例，女56例，年龄50～63(56.47±5.79)岁；体质量指数19.55～26.78(22.92±3.69)kg/m2；病程3～15(8.23±4.12)年。并以同期医院健康体检者115例为健康对照组，男59例，女56例，年龄51～64(57.06±5.93)岁；体质量指数19.04～26.90(23.06±3.74)kg/m2。2组性别、年龄、体质量指数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核批准，受试者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 选择标准 (1)诊断标准：依据“中国高血压防治指南2010”[6]修订的高血压视网膜病变的判定标准。(2)纳入标准：①所有患者均经眼底病专业医生进行眼底检查，均符合HRP诊断标准；②生理病理检查资料完整者。(3)排除标准：①合并糖尿病、脂肪代谢异常、肥胖者；②合并严重肝肾功能不全、重度慢性肺阻塞者；③合并心肌梗死、心功能不全、不稳定性心绞痛者；④合并酗酒、吸烟者；⑤合并青光眼、视神经损伤等其他眼科疾病者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 临床资料搜集：收集、统计一般资料；检测所有研究对象收缩压、舒张压；采用葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖，胰岛素释放试验测定空腹胰岛素，生化仪器自动检测总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇。

1.3.2 血清miR-124、miR-143表达检测：2组受试者清晨空腹抽取肘静脉血5～6 ml，室温下静置约40 min，离心收集上层血清，于-80℃保存待测。采用实时荧光定量法(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测2组血清miR-124、miR-143表达水平。取出冻存血清，冰上解冻，加适量TRIzol(美国Qiagen公司)，参照其试剂说明书操作流程提取血清总RNA，检测总RNA的完整性、纯度、浓度。依据qRT-PCR反转录试剂盒miScript Ⅱ RT kit(德国QIAGEN公司)操作流程、注意事项配制逆转录反应体系20 μl，将血清总RNA转录成cDNA。反应程序37.2℃ 60 min，活化反应体系中的逆转录酶;逆转录94.8℃ 6 min，抑制逆转录酶作用，终止逆转录反应。将反应体系置于冰上8 min，加无酶水，混匀，于-20℃保存备用。qRT-PCR扩增检测采用miScript SYBR Green PCR Kit(德国QIAGEN公司)，反应体系配制依照其说明书进行，扩增程序为：94.8℃ 12 min；94℃ 20 s，62℃ 40 s，40个循环。待测miRNA、内参分别设置3个复孔进行定量检测。miR-124、miR-143均以U6为内参，对应引物序列见表1，两者相对表达量均采用2-△△CT计算[7]。

表1 miR-124、miR-143及内参U6的引物序列

1.3.3 VEGF、TNF-α、IL-6水平检测：上述血清采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测VEGF、TNF-α、IL-6水平，具体操作参照相应试剂盒说明书(试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)。

2 结 果

2.1 2组临床资料比较 与健康对照组比较，HRP组患者收缩压、舒张压明显升高(P<0.05)，空腹血糖、空腹胰岛素、总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 2组受试者临床资料比较

2.2 2组血清 miR-124、miR-143水平比较 与健康对照组比较，HRP组患者血清miR-124表达水平显著降低，miR-143表达水平显著升高(P均<0.01)，见表3。

2.3 2组血清VEGF、TNF-α、IL-6水平比较 与健康对照组比较，HRP组患者血清VEGF、TNF-α、IL-6水平显著升高(P<0.01)，见表4。

表3 2组受试者血清miR-124、miR-143水平比较

表4 2组受试者血清VEGF、TNF-α、IL-6水平比较

2.4 血清miR-124、miR-143水平与SBP、DBP、VEGF、TNF-α、IL-6水平关系 Pearson相关性分析结果显示，HRP患者血清miR-124与VEGF水平呈负相关(P<0.01)，miR-143与VEGF水平呈正相关(P<0.01)；血清miR-124、miR-143表达水平与SBP、DBP、TNF-α、IL-6水平均无明显相关性(P>0.05)， 见表5。

表5 血清miR-124、miR-143水平与SBP、DBP、VEGF、TNF-α、IL-6水平的关系

2.5 HRP危险因素的Logistic回归分析 以是否发生HRP为因变量，以SBP、DBP、VEGF、TNF-α、IL-6及血清miR-124、miR-143水平为自变量，行Logistic回归分析，结果显示SBP、DBP、VEGF、miR-143是HRP的危险因素(P<0.01)，miR-124是HRP的保护因素(P<0.01)， 见表6。

2.6 血清miR-124、miR-143对HRP的诊断价值 ROC曲线显示，血清miR-124对HRP预测诊断的曲线下面积(AUC)为0.838(95%CI0.787～0.889)，截断值为0.91，其敏感度、特异度分别为84.1%、71.3%，约登指数为0.554；血清miR-143对HRP预测诊断AUC为0.870(95%CI0.823～0.918)，截断值为1.28，其敏感度、特异度分别为84.2%、78.3%，约登指数为0.625；两者联合对HRP诊断的AUC为0.947(95%CI0.920～0.975)，其敏感度、特异度分别为94.7%、82.7%，约登指数为0.774，见图1。

表6 Logistic回归分析HRP的影响因素

3 讨 论

HRP是高血压持续一段时间后引起眼底血管及相关部位发生可视变化的心血管疾病，其在高血压患者群体中发病率较高，可对患者视觉造成不可逆的损害[7]。因此，寻找可靠且高效的诊断指标及影响因素，对提高患者生活质量具有重要意义。

miRNA是广泛存在于人体内各器官、组织及血液中的单链核苷酸RNA分子，在细胞增殖、炎性反应、信号转导、组织分化等生物学过程中起一定调控作用[8]。miRNA参与高血压性心力衰竭、肾衰竭、肾纤维化、心脏肥大、出血性脑卒中及眼病等高血压相关的病理过程[9]。miR-192-5p主要分布于肾脏中，其在高血压患者中低表达，可预防高血压的发展[10]。miR-7-5p在伴左心室肥大的高血压患者血清中表达上调，其可能在高血压性左心室肥大的发病进展中发挥重要作用[11]。miR-21在高血压肾损伤患者尿液中表达异常，与肾损伤的功能标志物相关，可作为高血压肾损伤和纤维化的潜在生物标志物[12]。以上研究证明，miRNA表达异常与高血压及高血压相关性疾病的发病进程密切相关，miR-124在青光眼中发挥调节作用，可促进Müller细胞衍生的视网膜神经节细胞生长，具有治疗青光眼的潜力[13]。Caruso等[14]研究发现，miR-124在肺动脉高压患者肺血管、内皮细胞中呈低表达，其可作为治疗肺动脉高压的新型治疗靶标[14]。以上研究表明，miR-124在动脉血压升高的疾病中发挥重要作用。本研究中HRP组患者血清miR-124表达水平显著下调，与miR-124在脑卒中倾向的自发性高血压中趋势类似[4]，提示血清miR-124表达水平可能影响HRP的发生发展过程。推测miR-124可能是通过调节盐皮质激素受体基因NR3C2的表达，降低肾素—血管紧张素系统的传导信号，进而降低血压[15],从而影响HRP的发生发展。miR-143-3p是miR-143家族成员，其在妊娠期高血压中呈过表达，可用于筛选心血管疾病后期发展风险较高的患者[16]。miR-143在高血压发展过程中表达失调，其可能参与并影响高血压发生与发展[17]。以上研究表明，miR-143表达失调与高血压疾病有关。本研究中HRP组患者血清miR-143表达水平明显上调，提示miR-143可能在HRP发展进程中起到重要调节作用。miR-143可维持血管收缩性，参与动脉血压的变化[15]，进而HRP发病进程。

微血管形成是视网膜发生病变的重要环节，VEGF是血管形成不可或缺的相关因子，能够促进血管内皮细胞分裂，加速血管新生[18]。HRP是一种炎性疾病，TNF-α、IL-6是重要的促进炎性的细胞因子，两者可反映炎性程度[19]。Liu等[20]发现VEGF、TNF-α在重度子痫前期患者视网膜中表达水平上调，表明VEGF、TNF-α可能在重度子痫前期引起的视网膜病变中发挥作用。IL-6在HRP患者血清中呈高水平表达，经非诺贝特治疗后，其水平降低，表明IL-6可能参与HRP的发生、发展[19]。本研究中HRP组患者血清VEGF、TNF-α、IL-6水平明显升高，提示HRP的发生与血管内皮调节、炎性因子的作用关系密切。推测VEGF过表达可促进血管内皮细胞增殖，其可能通过增加血管通透性，促进血管内皮细胞迁移及血管新生，进而参与HRP发生发展；TNF-α可一定程度损害血—视网膜屏障，增强视网膜血管通透性，引起血管内皮细胞增殖及血管外基质产生过量，进一步引发视网膜血管增殖，从而在视网膜病变中发挥促进作用；IL-6可通过诱导VEGF增加血管通透性，且其可通过细胞肌丝重排增加血管内皮细胞通透性，从而促使视网膜病变加重。

本研究显示，HRP患者血清VEGF水平与miR-124表达水平呈负相关，与miR-143表达水平呈正相关，提示miR-124、miR-143可能与VEGF相互作用，进而共同影响HRP的发病进展。分析原因，miR-124、miR-143作为miRNA成员，可能通过影响VEGF表达，调节血管内皮细胞增殖、分化、迁移，进而影响血管新生，从而影响HRP发病进程。进一步研究发现，SBP、DBP、VEGF、miR-143是HRP的危险因素，miR-124是HRP的保护因素，提示SBP、DBP、VEGF、miR-143等水平过高，miR-124表达水平过低，均可能增加HRP患病风险，及时动态监控血清中miR-124、miR-143水平，有助于早期判断并及早控制HRP的病情发展。血清中miR-124、miR-143水平对HRP的预测AUC分别为0.838、0.870，当血清miR-124相对表达量低于0.91或血清miR-143相对表达量高于1.28时，HRP患病几率较高，提示血清miR-124、miR-143对HRP有一定诊断价值，血清miR-124、miR-143联合诊断HRP的AUC为0.947，其敏感度94.7%，特异度为82.7%，提示miR-124、miR-143联合诊断价值高于单独诊断，两者联合可增加对HRP诊断的效能。

综上所述，HRP患者血清中miR-124表达下调，miR-143表达上调，两者可能参与HRP的发病发展过程，两者联合可增加HRP诊断价值，具有临床参考价值。但该研究试验样本较少，结果可能存在一定偏差，且本研究检测指标血清miR-124、miR-143对HRP的诊断价值未与SBP、DBP及临床诊断指标做比较，后续研究将加大样本量进行较深入的研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

韩月圣：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；焦瑞雪：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；张爱雪：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；崔迎欣：进行统计学分析；张乘瑞：课题设计，论文撰写