BDNF Val66Met基因多态性与老年糖尿病患者认知功能损害的相关性

刘佳，罗鸿宇，王洁妤，张丽，但小娟，杨伟

糖尿病是老年人群的常见疾病，常伴随着认知功能损害，其阿尔茨海默病(AD)发病率增高[1-2]。然而目前糖尿病出现认知功能损害的确切机制仍不明确。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神经营养素家族的一员，与神经元的生长、分化、增殖、可塑性及大脑的认知和记忆密切相关[3]。有研究证实，血BDNF水平在AD和糖尿病患者中下降[4-6]，但也有研究结果却不一致[7-8]，可能是由于血清BDNF易受降糖降脂药物、生活方式如运动、吸烟和饮酒等多种因素的影响[9]。Val66Met基因位于BDNF基因的编码外显子，其G/A多态性导致编码的第66位氨基酸发生缬氨酸—甲硫氨酸(Val-Met)转换，从而影响BDNF分泌[10]。有研究发现，在健康人群中风险等位基因A携带者海马体积和海马相关记忆下降, 可能与AD发病相关[11-12]。糖尿病人群与健康人群比较，A等位基因携带者延迟回忆能力减退[4]。但该位点与老年糖尿病人群认知功能下降是否相关目前少有报道。本研究分析了老年糖尿病患者认知功能障碍与BDNF基因多态性的相关性，探讨2型糖尿病认知功能损害的可能机制，以期望为糖尿病认知功能损害提供个体化治疗依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2018年1月—2019年5月首都医科大学宣武医院老年科诊治糖尿病患者(年龄≥65岁)592例，其中认知损害(CI)组189例，认知正常组403例，见表1。本研究经医院伦理委员会批准，入组对象或家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 入组标准 纳入标准：(1)年龄≥65岁；(2)糖尿病诊断标准符合“中国2型糖尿病防治指南2017年版”[13]；(3)文化程度在初中及初中以上者。排除标准：(1)影像学检查有明确神经系统疾病史(脑血管病、帕金森病等)；(2)严重内科疾病不能配合检查者，中重度贫血及甲状腺功能减退者；(3)糖尿病高渗或酮症酸中毒；(4)明确的精神疾病等；(5)严重视力或听力障碍。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 临床资料：(1)临床特征，包括身高、体质量、体质量指数(BMI)、疾病情况及降糖药用药信息[二甲双胍、胰岛素、噻唑烷二酮类、二肽基肽酶4(dipeptidy1 peptidase-4, DPPⅣ)抑制剂]等；(2)生化指标，空腹血糖(FPG)，糖化血红蛋白(HbA1C)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)；胰岛素抵抗指数(HOMA2-IR) 通过计算软件(www.ocdem.ox.ac.uk)获得[14]；(3)认知功能评定，采用简易智能评估量表(MMSE)评估，共30项，分为定向力、短时记忆、计算及注意力、延迟回忆和语言能力等5部分，总分范围0～30分。根据中国痴呆与认知障碍指南写作组制定的认知障碍标准，文盲组≤19分，小学组≤22分，初中以及上≤ 26分为认知功能损害[15]。

1.3.2 基因分型检测：采取静脉血5 ml抗凝处理，按照QIAGEN公司基因组DNA提取试剂盒说明书操作提取DNA。BDNF Val66Met上游引物5’-AAGAAGCAAA-CATCCGAGGACA-3’,下游引物5’-GGGATTGCACTTGGTCTCGTAG-3’，引物由上海生工合成。然后应用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术扩增目的DNA片段。酶切产物用3%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，根据电泳条带迁移速率不同进行分析，对BDNF Val66Met进行基因分型。

2 结 果

2.1 2组临床资料比较 2组的性别、年龄、高血压病史、BMI水平、Ln HOMA2-IR及其他口服降糖药物相比，差异无统计学意义(P均>0.05)。与认知正常组比较，CI组的糖尿病病程、HbA1C、血LDL-C、空腹血糖水平增高，而受教育时间(年)偏低及口服二甲双胍比例下降(P均<0.05)，见表1。

2.2 2组BDNF Val66Met 基因多态性比较 其在总人群中分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，最小等位基因(A)频率为46.6%。虽然3种基因型GG、AG、AA在CI组和认知正常组之间分布差异无统计学意义(P>0.05)，但是风险等位基因A在CI组中分布明显高于认知正常组(51.1%vs.44.5%，P=0.036)，见表1。

表1 2组一般资料和BDNF基因多态性分布比较

2.3 BDNF基因多态性与MMSE分值的相关性分析

2.3.1 BDNF基因多态性MMSE分值比较：在总人群中等位基因A携带者的语言能力及定向力、延迟回忆分值低于非携带者(P<0.05)，但在MMSE总分值、短时记忆和计算能力方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 BNDF Val66Met基因多态性中MMSE各项分值的比较分)

2.3.2 BDNF风险等位基因与MMSE分值的线性相关分析：进一步分析BDNF Val66Met风险等位基因A与MMSE总分以及各分值的相关性(见表3)。采用线性回归分析，调节表1有显著差异的相关因素后，每拷贝风险等位基因A与MMSE(β=-0.096,P=0.011), 定向力(β=-0.155,P<0.001)，延迟回忆(β=-0.134,P=0.001)呈负相关，但在短时记忆、计算及注意力和语言能力方面无显著相关性(P>0.05)。

2.4 糖尿病患者认知功能障碍的多因素分析 将表3中有统计学意义(P<0.05)的因素采用Logistic多因素回归分析，结果显示，糖尿病病程、FPG、HbA1C、LDL-C是糖尿病认知功能障碍的独立危险因素，受教育时间和口服二甲双胍是糖尿病认知功能障碍的保护因素(P均<0.05)，见表4。此外，BDNF Val66Met是糖尿病人群认知功能障碍风险基因，其等位基因A携带者(AA+GA)认知障碍发病风险是非携带者的1.696倍(95%CI1.119～2.569，P=0.013)。高血压与老年糖尿病患者认知功能减退无明显相关性(P>0.05)。

表3 BDNF风险等位基因与MMSE各项分值的相关性分析

表4 老年糖尿病患者认知功能障碍多因素Logistic回归分析

3 讨 论

研究发现，与非糖尿病人群比较，糖尿病患者认知功能障碍的发生率增加了1.5倍，其危险因素主要包括血糖代谢紊乱、胰岛素抵抗、血脂异常、血压增高、肥胖及遗传因素如APOE基因等[2]。而近期针对糖尿病人群横断面研究发现，认知损害组在脑卒中、高血压及抑郁方面比例均高于糖尿病认知正常组，而在饮酒、吸烟、血脂水平、空腹血糖、BMI及APOE风险基因方面差异无统计学意义[16-18]。而本研究发现，糖尿病病程、HbA1C及LDL-C水平增高均是糖尿病认知功能下降的危险因素，但并未发现高血压人群在认知损害组中比例增高，可能与高血压本身就是脑卒中的高危因素有关，既往研究中未除外脑卒中患者，糖尿病所造成的认知功能损害可能混入了高血压导致的脑卒中从而引起认知功能下降，此外既往研究对象还包含了抑郁症患者，因此导致了结果的差异。而本研究在研究对象选择方面除外糖尿病合并脑卒中和抑郁症患者，其相关性结果更能准确体现糖尿病与非血管性认知功能障碍及阿尔茨海默病(AD)之间的联系。目前二甲双胍与糖尿病认知功能的相关性无一致结论，有研究发现，二甲双胍造成的维生素B12和钙的缺乏可以增加认知功能损害的风险[19-20]，但另一些研究却相反[21-22]，本研究显示二甲双胍是糖尿病患者认知功能损害的保护因素，补充维生素B12及钙剂是否与二甲双胍对认知功能的影响有关，还需进一步研究证实。

血BDNF水平在T2DM 人群中较正常人群降低[4-6]，而BDNF Val66Met 基因多态性可以影响BDNF细胞内运输和活动依赖性分泌从而影响BDNF的功能[10]。 该基因多态性分布频率因人种的不同而出现差异，在亚洲人群A等位基因的分布频率最高达48.1%[23]，较欧洲人群增高2倍以上[6]。在亚洲人群中研究发现，对比T2DM和正常组人群认知功能，2组间基因分布频率无显著差异，但在延迟回忆分值方面A等位基因携带者较非携带者显著下降[24-26]。因此推测BDNF Val66Met 基因多态性并非直接影响了T2DM易感性，而是对糖尿病患者部分认知域下降造成了影响。糖尿病认知功能损害常伴随多个认知域，如即刻记忆、延迟记忆、学习和执行能力的下降[21]。本研究以老年人群为研究对象，结果显示在总人群中A等位基因分布频率为46.6%，并发现风险等位基因A增加可导致延迟回忆分值下降，与以往研究一致[4]。此外A等位基因携带者在定向力和语言能力方面分值较非携带者下降。在调整学历和糖尿病病程等其他危险因素后，提示BDNF Val66Met可能是老年T2DM认知功能损害的独立危险因素。

目前BDNF Val66Met对认知功能影响的机制尚不明确。一方面，有研究发现，Val66Met基因突变在健康人群中可以影响海马相关的记忆功能和海马体积[12]，与正常人群海马相比，散发型阿尔茨海默病患者海马中BDNF表达明显降低，这些结果提示BDNF基因突变及造成随后蛋白水平的变化可能与AD的早期病理改变有关[11-12]。此外该位点还能通过影响神经元BDNF的功能，与一些神经系统和精神疾病相关。另一方面，Val66Met位点突变导致BDNF表达下降，而BDNF可以通过刺激生长激素抑制素的表达增加β-淀粉样蛋白的降解[27]，从而导致AD的发生。在糖尿病人群中，胰岛素抵抗和高胰岛素血症，可能导致脑内胰岛素作用减弱，Aβ生成增多和降解减少，从而使神经元产生退行性改变[2,28]，可形成AD的相关病理改变，出现认知功能障碍。此外，糖尿病病变本身出现的颅内微血管慢性缺血病变，也会造成认知功能的损害。而BDNF Val66Met多态性是否会加剧糖尿病人群胰岛素抵抗、高胰岛素血症及微血管病变需要更进一步的研究。

总之，本研究发现BDNF Val66Met基因是老年糖尿病患者认知功能损害的风险基因，但是本研究为病例对照研究，BDNF Val66Met风险等位基因携带者对糖尿病患者认知功能障碍发病风险的影响还需要进一步前瞻性研究来证实。此外本研究的局限性还在于认知功能损害重要的风险基因APOE未纳入分析。故今后进一步扩大样本量，探讨2种风险基因对老年糖尿病患者认知功能的影响。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

刘佳:实施研究过程，数据统计分析，撰写论文；罗鸿宇、张丽：实施主要研究过程；王洁妤：设计研究流程和方案；但小娟:数据的统计和分析，进行文献调研与整理；杨伟：提出研究方向及思路，参与论文修改