大鼠深低温停循环抑制Akt信号通路影响认知功能

深低温停循环(DHCA) 作为心脏外科手术中的一项重要辅助方式，于1953年最早应用于成人心脏外科领域[1]。DHCA可为术者提供清晰视野，降低患者机体代谢率，延长缺血缺氧耐受时间，在主动脉弓部手术及复杂先天性心脏病的矫治手术中成为必不可少的辅助措施。近年来，随着DHCA技术的迅猛发展以及术者手术操作水平的提高，DHCA相关并发症的发生率及术后患者的死亡率明显下降。然而，脑神经系统并发症仍然是DHCA的严重并发症，DHCA辅助下半弓置换术新发脑血管事件的发生率为5.4%[2]，DHCA术后患者暂时性神经功能障碍的发生率高达25%[3]。DHCA心脏手术后12周内神经心理功能障碍的发生率更可高达55%[4]。本文通过建立大鼠DHCA模型，探究大鼠DHCA术后脑组织病理及认知功能等变化情况及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年雄性清洁级SD大鼠16只，体质量350～450 g。随机分为假手术组及DHCA组，每组8只。

1.2 DHCA模型构建

SD大鼠术前禁食12 h，应用1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)通过腹腔注射麻醉。取颈部正中切口，用14G套管针经气管穿刺插管，连接呼吸机，调整呼吸频率在60～70次/min，潮气量2 mL/100 g，根据血气分析结果调整参数以维持PaO2>60 mmHg，PaCO230～50mmHg，停循环期间暂停机械通气。左侧股部切开暴露股浅动脉，用24G静脉留置针穿刺置管，注射150 IU肝素抗凝，连接体外循环动脉灌注端。暴露右侧颈外静脉，用自制多孔14G套管针穿刺置管，连接体外循环静脉回流端。暴露右侧颈外动脉，用24G静脉留置针穿刺置管，连接多导生理监护仪监测生命体征，温度计润滑后插入大鼠肛门监测体温。

体外循环由储血器、小动物膜肺、蠕动泵、氧气源、硅胶管道、输液管、变温水箱组成。管道预充液：6%羟乙基淀粉8 mL、5%碳酸氢钠1 mL、肝素1 mL(100 IU/mL)[5]。管路自循环排气。体外循环30 min降温至18 ℃，停循环1 h，再灌注复温30 min使体温达到34 ℃，逐渐减少流量，停机撤除体外循环。继续机械通气至大鼠基本恢复正常自主呼吸，拔除气管插管，缝合各切口，置于富氧环境中观察。假手术组只进行插管操作，不进行体外循环及DHCA。于体外循环前、降温20 min时、复温20 min时、停止体外循环前采集动脉血行血气分析。

1.3 Western blot法检测海马组织相关蛋白表达

再灌注4 h后，每组取4只SD大鼠处死，取脑组织保存于-80℃冰箱。分离出海马组织匀浆，采用BCA法进行蛋白定量，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，转膜，孵育一抗过夜，孵育荧光二抗后分别检测两组海马组织中丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、B淋巴细胞瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化胱天蛋白酶-3(cleaved caspase-3)的蛋白表达水平，以GAPDH为内参。

1.4 Morris 水迷宫实验

每组取4只SD大鼠于术后第1天开始行Morris水迷宫实验，以评估空间学习记忆及运动功能。水迷宫由直径150 cm、高60 cm的圆形水池及相应摄像机和数据分析软件组成，向水池中注入适当清水，并加入墨汁使其呈不透明状态，将水池平均分为4个象限，每个象限内壁画有固定参照物，选择其中1个象限中央放入直径12 cm、高50 cm的黑色圆形平台，低于水面约2 cm，且保持位置不变[6]。水迷宫实验由两部分组成，术后第1天为预实验，选择一固定位置将大鼠放入水中，自由游泳120 s，使其适应环境并初步检验运动能力。术后第2～5天为定位航行实验，每天将大鼠面向池壁分别从4个不同象限参照物位置放入水中，记录大鼠找到隐藏平台的时间，该时间称为逃避潜伏期。如果找到平台，让其在平台上停留4 s，如果在120 s内未找到平台，则逃避潜伏期记为120 s，并由实验人员将其牵引至平台位置停留4 s。术后第6天为空间探索实验，撤去隐藏平台，任选同一象限，将大鼠面向池壁放入水中，记录其在120 s内跨越平台位置的次数及运动速度。

1.5 形态学检测海马组织病理损伤

每组取4只SD大鼠于术后第7天处死，经主动脉灌流后取完整脑组织于4%多聚甲醛中固定24 h，沿冠状面切取海马组织，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后石蜡包埋。制备成5 μm厚的石蜡切片用于HE染色及尼氏染色，光学显微镜下观察海马组织CA1区的病理形态学变化。HE染色后于400倍放大视野下观察异常细胞占总体的比例，病理学评分：0分=无损伤；1分=0%～12.5%损伤；2分=12.5%～25%损伤；3分=25%～50%损伤；4分=50%以上损伤[7]。尼氏染色后于400倍放大视野下计数存活神经元的个数。

1.6 统计学分析

采用SPSS 23.0软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，符合正态分布的计量资料两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，偏态分布的计量资料采用秩和检验。逃避潜伏期组间比较采用两因素重复测量的方差分析。HE染色病理学评分采用曼-惠特尼U检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组生理指标比较

DHCA组8只大鼠均顺利脱离体外循环，并恢复自主呼吸。各组生理指标如表1所示。两组大鼠术前体质量、平均动脉压、心率、体温、pH值、PaO2、PaCO2的差异无统计学意义。在降温及复温期间，DHCA组的平均动脉压及心率低于假手术组(P均<0.05)，在停机前，DHCA组平均动脉压及心率仍低于假手术组(P均<0.05)，可能因停循环对心功能产生影响，导致术后心率、血压未能立刻恢复至术前状态。在反映大鼠机体酸碱平衡的指标中，DHCA组的pH值在降温及复温过程中均低于假手术组(P<0.05)，呈现一定程度的酸中毒。DHCA组PaCO2在体外循环期间低于假手术组(P均<0.05)，停机前与假手术组无统计学差异。

表1 假手术组与DHCA组大鼠生理指标比较

注：与假手术组比较，(1)P<0.05

2.2 两组海马组织相关蛋白表达水平的比较

在大鼠海马组织中，DHCA组与假手术组Akt的蛋白表达水平无统计学差异，DHCA组p-Akt蛋白表达水平、p-Akt/Akt的比值较假手术组明显降低(P均<0.05)。DHCA组抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显低于假手术组，促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3的表达水平明显高于假手术组(P均<0.05)。见图1、表2。

2.3 两组Morris水迷宫结果比较

在定位航行实验的第1、2、4天，假手术组的逃避潜伏期均小于DHCA组(P均<0.05)，第3天两组的逃避潜伏期无统计学差异。经过4 d的训练，两组第4天的逃避潜伏期均小于第1天(P均<0.05)，假手术组第4天与第1天的差异较DHCA组更明显。空间探索实验中，DHCA组大鼠跨越原有平台位置的次数较假手术组明显减少，运动速度明显低于假手术组(P均<0.05)。见表3。

图1 Western blot检测两组大鼠海马组织相关蛋白表达情况

表2 两组大鼠海马组织相关蛋白表达水平比较

注:与假手术组组相比，(1)P<0.05

表3 两组大鼠Morris水迷宫结果比较

注:与假手术组相比，(1)P<0.05

2.4 两组形态学结果比较

术后第7天对两组大鼠的脑组织海马CA1区进行组织病理学评估。HE染色可见假手术组的神经细胞形态正常，细胞核形态清晰，细胞膜及胞浆结构完整；DHCA组部分神经元胞体肿胀，海马CA1区神经细胞呈现病理改变，主要包括核固缩、三角形核形态、神经细胞皱缩、嗜酸细胞浆变化等，正常神经细胞比例低于假手术组，病理评分明显高于假手术组[(2.50±0.58)分对(0.50±0.58)分，P<0.05]。两组大鼠海马CA1区尼氏染色结果显示，假手术组海马神经细胞排列整齐，细胞形态及层次清晰，尼氏体染色较深、分布均匀；DHCA组细胞排列紊乱，尼氏体淡染，正常神经细胞数目明显少于假手术组[(48.25±3.50)个对(68.25±2.63)个，P<0.05]。见图2。

图2 两组大鼠海马CA1区HE染色、尼氏染色结果

3 讨论

本研究通过建立大鼠DHCA模型评估术后脑损伤，在大鼠损伤程度最轻的情况下还原手术中DHCA的降温、停循环、复温过程，以减少其他因素对大鼠脑组织的影响。DHCA脑损伤本质上是一种全脑的缺血再灌注损伤，海马是对缺血较敏感的区域[8]。本研究发现，在DHCA组大鼠中，显微镜下可见海马CA1区部分神经细胞出现病理形态学改变，正常神经细胞数目少于假手术组，提示DHCA对大鼠脑组织造成了损伤。

研究表明，低温可降低脑组织的氧消耗，相对减轻脑组织的能量消耗，DHCA后脑神经元坏死并非主要病理改变，线粒体功能障碍和其触发的神经元凋亡才是脑缺血再灌注损伤的主要机制[9]。凋亡是细胞为维持内环境稳定而发生的程序性死亡，但凋亡过多则是病理现象，可引起持续性脑损伤，海马回、齿状回神经元凋亡与创伤后的认知缺陷、行为改变关系密切[10]。Bcl-2家族在细胞凋亡中起重要作用[11]，其成员包括抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL和促凋亡因子Bax、Bad、Bid[12]，Bcl-2与Bax的相对平衡与细胞的凋亡和存活密切相关[13]，Bcl-2通过抑制细胞凋亡促进细胞存活，Bax则诱导细胞凋亡。下调Bax/Bcl-2的比值可以抑制脑缺血所致海马神经元损失，并提高认知功能[14]。Bax可能是Bcl-2家族中最重要的促凋亡因子，Bax与Bcl-2结合后形成的异二聚体是发挥Bcl-2抗凋亡作用的关键。Caspase是导致细胞凋亡的蛋白酶家族，作为凋亡的执行者发挥重要作用[15]。脑缺血后，caspase-9可激活线粒体介导的神经细胞凋亡[16]，在死亡受体介导的凋亡通路中，caspase-8被激活[17]。二者均可使caspase-3前体裂解，产生具有活性的caspase-3片段，进而促进DNA修复蛋白、细胞骨架蛋白等裂解，最终导致细胞凋亡。本研究中，DHCA组大鼠经过脑缺血再灌注损伤，海马中的Bcl-2蛋白表达减少，Bax及cleaved caspase-3蛋白表达增加，提示DHCA组大鼠抗凋亡能力下降，DHCA通过诱导细胞凋亡引发脑损伤。

磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信号通路与脑缺血再灌注损伤中的神经细胞凋亡密切相关。Akt处于该信号通路的核心位置，介导多种生物学效应，是重要的抗凋亡调节因子[18]。Akt磷酸化后成为p-Akt，通过多条信号通路抑制细胞凋亡，促进细胞存活[19]。在脑神经系统中，p-Akt可作用于下游的Bcl-2家族[20- 21]、caspase家族[22-23]等与凋亡直接相关的因子，使其磷酸化并失去活性，进而促使抗凋亡基因转录和表达，促进细胞存活。本研究中，DHCA组海马组织中p-Akt/Akt减少，提示大鼠经过DHCA后，抗凋亡调节因子p-Akt表达减少，抗凋亡能力下降，进而加重术后神经细胞凋亡，引起脑损伤。p-Akt表达的变化趋势与上述Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表达的变化趋势相对应，进一步说明DHCA通过Akt信号通路影响下游相关靶蛋白的表达，促使神经细胞凋亡，引起脑损伤。

记忆学习功能是大脑的高级功能之一，认知及学习能力下降是脑损伤的重要标志，而海马组织在学习、记忆、空间感知中发挥着极其重要的作用[24]。本研究利用DHCA对海马组织造成缺血再灌注损伤，采用Morris水迷宫测试大鼠在DHCA术后的学习记忆及空间感知功能。研究发现，DHCA组大鼠的逃避潜伏期延长，说明DHCA组大鼠在学习记忆方面存在缺陷，有一定程度的损伤。在最后一天的空间探索实验中，DHCA组大鼠经过原有平台的次数明显减少，运动速度下降，说明DHCA对大鼠的空间感知能力、运动能力有一定影响。

综上所述，本研究证实神经细胞凋亡是DHCA缺血再灌注后脑损伤的主要机制，DHCA可能通过抑制p-Akt，影响下游凋亡相关因子的表达，从而对大鼠的学习记忆、空间感知、运动能力造成损伤。增加p-Akt的表达可能抑制神经细胞凋亡，对DHCA的脑损伤产生保护作用。