贻贝黏蛋白体外抗单纯疱疹病毒-2型的作用

宋莎莎 李新宇 王永芳

海洋生物的多样性以及活性功能的独特性在医药领域的应用已受到人们的重视[1]。贻贝黏蛋白(mussel adhesive protein, MAP)为海洋紫贻贝的足丝腺中生成和储存的一种天然蛋白质，经提取纯化后成为一种多酚类单一蛋白生物材料[2]。MAP分子结构中因含有20%的赖氨酸，使该蛋白具有较高的等电点，在人体生理pH值条件显示很强的正电荷性能。而人体的各类细胞往往带有负电荷，因此MAP可通过静电相互作用与细胞结合，在生物医药领域展现出极具潜力的应用价值，如用于生物医用粘接、形成保护膜以及体外组织培养时促进细胞贴壁爬行等[3～5]。MAP在促进创面愈合、止痒和抑菌方面的作用也有报道[6～9]。MAP具有的保护膜特性对于保护组织免于病原体侵害亦具有重要意义。

人单纯疱疹病毒(HSV)是侵犯人类的常见病原体，属于疱疹病毒科α病毒亚科，分为 HSV-1和HSV-2两个血清型，前者常引起唇疱疹，后者是生殖器疱疹的主要病原体[10]。生殖器疱疹是我国发生率较高的性传播疾病之一，该病容易复发，可导致胎儿发育畸形。目前临床上常用的抗HSV药物仍然以嘌呤核苷类似物为主，如阿昔洛韦类、喷昔洛韦等，但随着耐阿昔洛韦HSV株的出现，寻找具有对抗HSV活性的新物质极其重要。本研究利用HSV-2体外感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)模型，观察MAP对HSV-2感染是否具有保护性。

材料与方法

1.主要仪器与试剂：ECLIPSE TS100倒置相差显微镜(日本Nikon公司)；酶联免疫检测仪(美国Thermo Scientific公司)；二氧化碳培养箱(美国Thermo Scientific股份有限公司)；超低温冰箱(青岛海尔公司，DW-86L486)； RPMI1640培养基(美国GIBCO公司)；新生牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT，美国Sigma公司)。

2.试验药材：贻贝黏蛋白冻干粉(MAP，江阴贝瑞森生化技术有限公司，纯度87.04%，用氯化钠注射液溶解成20μg/μl原液，临用前用含10%血清的RPMI 1640培养液或含2%血清的RPMI 1640维持液配制)；十二烷基磺酸钠(SDS，美国Amresco公司，纯度99%，临用前用培养液或维持液配制)；阿昔洛韦(ACV，江苏知原药业有限公司，纯度99.3%，临用前用培养液或维持液配制)。

3.细胞株和病毒株：非洲绿猴肾细胞(Vero细胞，上海细胞生物研究所细胞库)；HSV-2质控株(sav，中国药品生物制品检定所)。

4.HSV-2病毒扩增：将HSV-2病毒液接种至单层生长的Vero细胞中，吸附1h后去除，补充维持液于37℃、5%CO2下继续培养，镜下观察直至95%以上细胞出现明显病变，即细胞肿胀或变圆。将吸附病毒后的细胞反复冻融，3000r/min离心10min去除细胞沉淀物，上清少量分装，低温保存。

5.病毒毒力测定：对数期Vero细胞收集并计数后，以2×104/孔密度接种于96孔板，于37℃、5%CO2下培养过夜，镜下观察细胞长成单层。取上述收集的病毒液，用维持液依次10倍稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-77个稀释度，分别接种至单层Vero细胞中，0.1毫升/孔。吸附1h后去除上清，用维持液冲洗细胞2次，补充维持液继续培养。每个稀释度重复3孔，实验设正常细胞对照，24h后显微镜下观察细胞病变效应。病毒半数感染剂量(TCID50)计算：按Reed和Muench常规法计算，即TCID50= >50%病变率稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数；距离比例=(>50%病变百分数-50%)/(>50%病变百分数-<50%病变百分数)。

6.受试物对细胞毒性测定：采用形态观察法结合MTT法进行，MAP和对照药ACV以及SDS均用培养液稀释成4个浓度，即MAP为500.0、250.0、125.0、62.5μg/ml；ACV为100.0、50.0、25.0、12.5μg/ml；SDS为250.00、125.00、62.50、31.25μg/ml。将已稀释好的药液加入到长成单层Vero细胞的培养板中，0.2毫升/孔，每个浓度重复3孔，同时设正常细胞对照和空白对照孔。培养24h后显微镜下观察细胞生长情况和形态变化，计数3个视野中形态发生改变的细胞百分率。计算半数中毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。观察完毕后加5mg/ml的MTT 20微升/孔，孵育4h，弃各孔上清液，每孔加DMSO 150μl，室温暗处震荡10min，在MULTISKAN APECTRUM酶联免疫检测仪上测定550nm处吸光度值(A550nm)，计算细胞存活率(%)。

7.MAP对HSV-2的直接影响作用：采用类似于中和实验中的方法，改良后进行，并以SDS作为阳性测试对照同步进行实验。根据病毒毒力测定结果，取200TCID50病毒液与等体积不同浓度的MAP(125.0000～7.8125μg/ml)或SDS(62.5000～3.9063μg/ml)混合，此时病毒液的终浓度为100TCID50，然后置37℃水浴孵育1h。将孵育后的病毒液接种至长成单层Vero细胞的96孔培养板中0.1毫升/孔。吸附1h后弃去，维持液冲洗2次，加入维持液0.2毫升/孔继续培养。每个受试浓度重复3孔，实验设溶媒对照、病毒对照以及正常细胞对照组。24h后显微镜下观察细胞病变率，并计算抑制作用的半数有效浓度(EC50)。

8.MAP对HSV-2感染Vero细胞后效应的抑制作用：以ACV作为阳性对照药同步进行实验。取100TCID50病毒液接种于长成单层Vero细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml。吸附1h后弃去，维持液冲洗2次，加入不同浓度MAP(125.0000～7.8125μg/ml)或ACV(100.00～6.25μg/ml)药液0.2毫升/孔，置于37℃、5%CO2中继续培养。每个受试浓度重复3孔，实验设溶媒对照、病毒对照和正常细胞对照组。24h后显微镜下观察细胞病变率，计算抑制作用的半数有效浓度(EC50)。

9.统计学方法：采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行统计分析，两个独立样本组间均数比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.病毒毒力测定：镜下观察正常Vero细胞呈梭形，细胞膜界限清晰，胞质透明度好，细胞形态完整，HSV-2感染所致的细胞病变表现为细胞肿胀、变圆甚至漂起，用Reed-Muench计算病毒的TCID50为10-4.55(图1)。

图1 倒置显微镜下不同稀释度的HSV-2致Vero细胞病变观察(×100)

2.MAP对Vero细胞生长形态的影响和毒性：受试物处理24h后首先观察细胞形态学改变，根据形态发生改变的细胞百分率计算的毒性结果见表1。用MTT法进一步测定后显示，MAP在500.0～62.5μg/ml受试浓度范围内Vero细胞的存活率在90%以上。对照药ACV在12.5～100.0μg/ml浓度内细胞存活率亦在90%以上。SDS在62.50～31.25μg/ml浓度Vero细胞存活率在70%以上，结果见图2。

表1 MAP和对照药作用于Vero细胞24h后根据细胞形态学改变计算毒性结果

3.MAP对HSV-2的直接影响作用：用不同浓度的MAP预先处理HSV-2后再感染Vero细胞，处理后的病毒所导致的细胞病变效应受到不同程度的抑制，且随着MAP浓度增大，抑制作用越明显，与溶媒对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，其EC50为54.88μg/ml。阳性对照测试物SDS对HSV-2亦表现出明显的直接影响作用，受其处理后的病毒导致的细胞病变效应受到明显抑制，EC50为22.10μg/ml，结果见图3和图4。

图2 MAP和对照药对Vero细胞的MTT测定结果A.MAP;B.ACV;C.SDS

图3 HSV-2经MAP和SDS预先处理后对Vero细胞引起的病变率A.MAP;B.SDS;与溶媒对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

4.MAP对HSV-2感染Vero细胞后病变效应的抑制作用：用HSV-2攻击Vero细胞后再加入MAP处理，观察到其对病毒导致的细胞肿胀效应有一定的抑制作用，与溶媒对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，抑制作用的EC50值>125μg/ml。对照药ACV亦表现出较强的抑制作用，EC50值为6.38μg/ml，结果见图5和图6。

图4 HSV-2经MAP和SDS预先处理后导致的细胞病变效应(×100)

图5 MAP和ACV对HSV-2感染Vero细胞后病变效应的抑制作用A.MAP;B.ACV;与溶媒对照组比较，**P<0.01

图6 MAP和ACV对HSV-2感染Vero细胞后病变效应的抑制作用(×100)

讨 论

HSV-2是一种重要的生殖器疱疹病原体，全球HSV-2感染率较高，是性接触的公共卫生问题之一。与HSV-1比较，HSV-2感染人体后能产生更高的病毒载量，并能通过其周围的神经轴突到达骶神经节并在此潜伏，因此潜伏感染、周期性复发是此病毒的致病特性，其并发症以生殖器溃疡最常见，在免疫力低下的患者甚至引起更严重的感觉神经和自主神经的急性炎症[11，12]。病毒在细胞内复制是复杂但又程序化的过程，即吸附、穿入、脱衣壳、DNA复制、转录、翻译、蛋白质合成、核衣壳组装和病毒的释放等多个环节，影响上述复制循环中任一环节均可能起到抗病毒感染作用。目前使用的抗病毒药物如阿昔洛韦、阿糖腺苷等，能抑制病毒DNA的复制，但不能彻底防止潜伏感染的复发，且抗病毒谱窄，较易产生耐药性，是发展抗病毒药关注的问题[13]。

近年来，随着生物技术的进步和组织工程学的发展，越来越多的生物材料被用于医疗领域。我国海洋资源物产丰富，海洋生物活性物质的利用已成为当今海洋生物技术的研究热点。MAP是从海洋紫贻贝的足丝腺中提纯的一种天然蛋白质，利用其高载量的正电荷能与细胞、病原体或病原体感染后的细胞相结合的特性，在保护皮肤免于感染方面具有一定优势[14]。

体外抗病毒活性研究通常采用细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)作为观察指标，评估受试物的抗病毒活性。本研究中笔者首先将MTT测定与形态学观察相结合，测试受试物自身对Vero细胞的生长活力是否有影响。MTT结果表明，MAP在500.0～62.5μg/ml范围对细胞活力并无明显影响，但在镜下可观察到MAP>125μg/ml浓度时，50%的细胞表现出折光性改变、边界模糊，提示此浓度下细胞虽未死亡，但生长仍然受影响。综合考虑实验结果，在后续的抗病毒试验时笔者以125μg/ml作为起始浓度。SDS是测试MAP对HSV-2直接影响时选择的阳性对照物。SDS是一种阴离子表面活性剂，广泛用于洗涤、消毒、日用品等方面，有研究表明SDS亦具有高效的抗HSV-2效应，并且它在1.25mg/ml浓度时不表现出对Vero细胞的毒性[15]。但本研究用观察法测得它对Vero细胞的无毒浓度≤62.5μg/ml，用MTT法进一步测得SDS在62.50～31.25μg/ml 浓度范围可保持Vero细胞的存活率在70%以上，而将浓度升高到125和250μg/ml时，细胞存活率低于10%，并且该结果在本实验中数次被证实。结合SDS在其他细胞的活性研究报道，在≥200μg/ml浓度时可使人牙周膜细胞全部死亡，在≤25μg/ml时则对该细胞的生长无明显影响[16]。笔者分析，所得到的细胞对SDS耐受浓度不一致结果可能与所用的SDS来源有关，笔者的实验以及牙周膜细胞实验均使用的是纯度≥99%的美国Amresco公司和美国Sigma公司产品，可能对细胞的作用更加敏感。

中和试验是用于测试病毒感染力的经典方法，包括固定病毒-稀释血清法和固定血清-稀释病毒法[17]。本研究采用的是中和试验方式并稍加改良，选择固定病毒-稀释血清(受试物)的测定方式来评估MAP对HSV-2的直接影响。用MAP与HSV-2作预混后，再将处理后的病毒去攻击Vero细胞，结果表明MAP对HSV-2产生直接影响，处理后的病毒导致的细胞病变效应受到抑制(EC50为54.88μg/ml)，提示MAP可降低甚至消除HSV-2对宿主细胞造成的攻击，使宿主细胞免于感染。推测MAP的这种作用可能与其分子特性有关，即通过封闭病毒包膜而影响其与宿主细胞的吸附，从而发挥抗病毒感染效应。当HSV-2感染Vero细胞后再给予MAP时，对病毒所致的细胞病变效应亦有一定的抑制作用，但所需的EC50在125μg/ml以上，提示增加MAP的浓度可能达到抑制HSV-2攻击宿主细胞后引起的病变效应。

综上所述，本研究结果表明MAP在对抗HSV-2感染方面具有抑制作用，提示其在抗HSV活性进而保护宿主免于感染方面具有一定的潜力。有关MAP是否能干扰病毒的基因复制、转录或蛋白合成还有待于进一步研究。