理冲汤对子宫肌瘤模型小鼠Th1/Th2平衡漂移的调控作用研究

王文娜 李冬华 刘 宇 邱甜甜 韦 超

子宫肌瘤(uterine fibroids)是子宫中最常见的良性平滑肌肿瘤，主要由子宫平滑肌细胞增生而成，临床表现可能包括月经过多、痛经、不孕、骨盆疼痛和骨盆压迫症状等，还可能包括尿路疾病或便秘等[1,2]。有研究发现子宫肌瘤的发生、发展与患者体内性激素水平紊乱、子宫肌瘤内细胞外基质的过量积累、抗凋亡基因的过表达、遗传基因的突变、免疫因子的调控等有关，年龄、体质、饮食习惯等也为子宫肌瘤的高危因素[3～5]。在国外，首选的治疗方法为手术切除，其次为使用米非司酮、避孕药、醋酸乌利司他等药物治疗，释放宫内节育器对症治疗，以及作为保守治疗的肌瘤动脉栓塞术和高频超声治疗(HIFU)等，但是由于患者年龄、体质、病情等因素的影响，上述各种方法均存在不足之处[6]。

近年来，中药治疗逐渐成为人们优先选择的一种治疗方法，而且笔者发现有研究显示肿瘤的发生与发展与Th1/Th2平衡的变化密切相关，正常情况下人体内处于相对平衡状态，而且这种平衡状态时由这两种细胞产生的细胞因子来调控，当平衡向Th1漂移时则会引发抗肿瘤免疫机制[7]。因此本实验将通过异种移植造模法制备小鼠子宫肌瘤模型，用理冲汤及阳性药物米非司酮进行干预，采用HE染色观测小鼠子宫平滑肌组织结构变化，采用超敏多因子检测法检测各组小鼠血清中各免疫相关细胞因子的浓度变化，探讨理冲汤通过调控Th1和Th2分泌的细胞因子来治疗子宫肌瘤的作用机制。

材料与方法

1.实验动物:CB-17 Scid雌性小鼠[购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0001]，未孕，6～9周龄，体质量19～21g，共24只。饲养于首都医科大学实验动物房，饲养条件达到SPF级标准。

2.实验药物:理冲汤出自《医学衷中参西录》一书，组成为生黄芪9g、党参6g、白术6g、生山药15g、天花粉12g、知母12g、三棱9g、莪术9g、生鸡内金9g。上述中药饮片购自北京同仁堂饮片有限责任公司。在参考并尊重原方使用方法的基础上，按以下方法熬制：按上述处方量取中药饮片，先后水提2次。第1次加药材8倍量水浸泡0.5h，煎煮1h，煎至将成，加陈醋少许；第2次加药材的6倍量水煎煮1h，煎至将成时加陈醋少许，合并煎液，过滤，减压(60℃以下，真空度0.05kPa)浓缩成相对密度为1.20～1.30(60℃)的稠膏，加蒸馏水配制成含生药1.7g/ml浓缩液，并对pH值、比重、卫生学进行检测，低温(0～4℃)保存，用前摇匀。

米非司酮(北京紫竹药业有限公司，RU-486，批号：43110911，规格：25毫克/片)，用0.5%羧甲基纤维素(美国Sigma公司，C5678)配制成悬液，浓度为0.7g/L。

黄体酮注射液(上海通用公司，130905)；苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸公司，0703121)；碱性成纤维细胞生长因子(美国SAB公司，70402)；表皮生长因子(美国SAB公司，70504)。

3.主要试剂与仪器：MSD试剂盒(优宁维生物科技股份有限公司，K15048D-1)；光学显微镜(日本Olympus公司，TH-200/OlympuS V-RFL-T)；MSD超敏因子电化学发光分析仪(美国MSD公司，QuickPlex SQ120)。

4.人子宫肌瘤细胞悬液的制备：准备好眼科剪、镊子等器材，高温高压消毒灭菌。操作时佩戴无菌手套，在无菌操作台上操作，用镊子取1cm3大小新鲜子宫肌瘤组织，剔掉血管和坏死部分，在含有青链霉素混合液的PBS中清洗3次，然后迅速将子宫组织移至置于冰板上的烧杯中，加入适量的DMED培养基，用眼科剪将组织迅速剪碎至均匀细小颗粒。用无菌吸管将DMEM液吸去后，将组织颗粒移至15ml离心管中，加入10ml 0.2%的Ⅰ型胶原酶进行消化，轻轻摇晃使组织颗粒与消化酶均匀接触，再将其放入37℃水浴锅中消化30～90min(消化时间视组织消化情况而定)直到组织块明显减小或成乳糜状即可；将离心管移出水浴锅，加入20%完全培养基终止消化，无菌吸管吸取上清液，用70mm细胞筛进行筛选，收集细胞滤液；12000r/min离心10min，用移液枪吸去上清液，然后加入完全培养基(DMEM、20%胎牛血清、1%青链霉素混合液)进行重悬，将细胞悬液接种到25cm3培养瓶中，置于37℃、5% CO2培养箱中进行培养；12～24h后对细胞进行观察，待细胞贴壁后进行细胞换液，之后48h换液1次；当细胞融合度达到80%时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA进行消化，加入完全培养基，配制成密度为1.5×106个/毫升子宫肌瘤细胞悬液备用。

5.子宫肌瘤小鼠模型的制备：模型组、理冲汤组、阳性药物组在接受异种移植之前，先腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液(2mg/kg)2周，再腹腔注射黄体酮注射液(2.5mg/kg)1周，以促进子宫发育，正常组注射等量0.9%氯化钠注射液；小鼠称重，戊巴比妥钠(0.15ml/10g)对小鼠进行麻醉，下腹部消毒备皮，横切暴露腹腔，钝性分离脂肪组织探查“Y”形子宫。提前在子宫肌瘤细胞悬液中加入伊文思蓝以确保注射部位可视化，1ml无菌注射器吸取有100μl子宫肌瘤细胞悬液(细胞数约为1.5×106个)注射于小鼠子宫右侧分角肌层，同时吸取10μl表皮生长因子、碱性成纤维细胞因子注射于子宫左侧分角相同部位；用可吸收缝合线逐层缝合腹腔切口，并滴加适量青-链霉素预防感染，适当对小鼠进行保温；定期观察小鼠状态，小鼠能够进行正常生理活动等后可进行后续实验。

6.药物干预:提前将药物在水浴锅中加热至30℃。理冲汤组每日灌服理冲汤浓缩液，用量为30.45g/kg(按照体表面积折算，用药量为成人等效剂量的3倍)。阳性药物组每日灌服米非司酮悬液，用药量为2.9mg/kg(为成人的等效剂量)。正常组和模型组小鼠每日灌服等量0.9%氯化钠注射液。连续灌服4周。

7.HE染色：光镜下对各组小鼠子宫进行肉眼观察，然后取子宫分角以上0.2cm相同部位一段子宫组织，约5mm3大小，10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，HE染色，于光镜(×200)下进行组织病理学观察。

8.MSD 超敏多因子电化学发光法：准备标准品：稀释液45加1ml到标准品中，充分振荡，室温放置15～20min，作为最高的浓度点，依次做4倍稀释，7个标准品+1个Blank；准备检测抗体稀释液：吸取检测抗体30μl，并用稀释液45补足1.5ml体积。准备清洗液：配置1×的PBS(0.05%吐温-20)待用。准备读板液：配置2×的读板液；清洗MSD板3次，每次150μl的清洗液；每孔加入50μl的样本和标准品，并用封口膜封上，室温振荡2h；清洗MSD板3次，每次150μl的清洗液；每孔加入配置好的25μl检测抗体，并用封口膜封上，室温振荡2h；清洗MSD板3次，每次150μl的清洗液；每孔加入150μl配置好的读板液，上机检测。

结 果

1.HE染色观察各组小鼠子宫平滑肌组织结果:正常组小鼠子宫平滑肌细胞整齐，外纵行肌与内环行肌分界清晰，内环行肌细胞呈流水状，腺体上皮为单层柱状上皮。模型组细胞排列紊乱且有明显增生，胶原纤维与细胞间质增多，细胞界限不清，细胞核多呈长杆状，外纵行肌与内环行肌分界不清，腺体细胞增生，基本为复层柱状上皮或假复层柱状上皮。理冲汤组平滑肌细胞排列较为整齐，增生情况较之于模型组大有缓解，外纵行肌与内环行肌分界比较清晰，腺体上皮基本为单层柱状上皮。阳性药物组平滑肌细胞排列较为整齐，细胞增生情况较之于模型组略轻，外纵行肌与内环行肌分界比较清晰，腺体上皮基本为单层柱状上皮(图1)。

图1 各组小鼠子宫平滑肌组织的变化(HE，×200)A.正常组;B.模型组;C.理冲汤组;D.阳性药物组

2.MSD超敏多因子电化学发光法检测子宫肌瘤模型小鼠血清中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10的浓度：与正常组比较，模型组小鼠血清中的IL-2、IFN-γ的浓度显著降低(P<0.01)，而IL-4、IL-5、IL-10的浓度显著升高(P<0.05，P<0.01)；阳性药物组的IL-4、IL-5、IL-10的浓度也显著升高(P<0.05，P<0.01)，理冲汤组仅IL-5的浓度与正常组比较显著升高(P<0.01)，详见表1。与模型组比较，理冲汤组小鼠血清中的IL-2、IFN-γ均显著升高(P<0.05，P<0.01)，IL-4、IL-5、IL-10的浓度均显著降低(P<0.05，P<0.01)；而阳性药物组中的IL-2、IFN-γ均显著升高(P<0.05，P<0.01)，但IL-4、IL-5、IL-10的浓度变化差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 小鼠血清中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10的浓度

与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

讨 论

已有研究表明，肿瘤的发生、发展与免疫系统介导的免疫逃逸机制密切相关。肿瘤细胞由于表观遗传的改变和基因组的不稳定性而出现变异，免疫原性降低，平衡阶段的休眠状态被破坏，进而变异的肿瘤细胞会在淋巴细胞和细胞因子的压力下进入逃逸阶段，并建立免疫抑制性肿瘤微环境，进行无限制的生长繁殖，最终形成临床上所见的肿瘤。而在这个免疫逃逸过程中T淋巴细胞(简称T细胞)和各类细胞因子发挥了重要作用[8]。

笔者观测的细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10主要是由淋巴细胞中的T细胞的亚群——辅助性T细胞分泌，此类细胞又被称为Th细胞，其中的Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等，Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等[9，10]。因此，IL-2、IFN-γ的表达能够促进Th1型免疫应答，而IL-4、IL-5和IL-10的表达能够促进Th2型免疫应答。

在正常情况下机体内Th1/Th2细胞处于平衡状态，当Th1细胞及其细胞因子占优势之时便有抗肿瘤之功能，有研究称Th1细胞可以通过将M2巨噬细胞转换为经典的促炎性M1巨噬细胞来抑制肿瘤，而且IL-2具有增强B细胞杀伤效应的功能，IFN-γ更是多效细胞因子，能够参与肿瘤免疫编辑的3个阶段及炎性介导的肿瘤发生的过程，能够防止肿瘤复发并能使其进入休眠状态[7，11～13]；但Th2细胞及其细胞因子占优势之时能够使肿瘤逃脱免疫系统监视，有研究称IL-4为Th2型细胞反应的起始物而且能够促进M2巨噬细胞极化，还能够将常规自然杀伤(cNK)细胞转化为IL4-NK细胞进而能够分泌IL-10，调节Th1/Th2平衡[13～15]。而IL-5不仅自身与其受体结合后能诱导肿瘤细胞的转移还能通过MMP-9/NF-κB/AP-1等途径来调节肿瘤细胞的转移[16]。Th2细胞占优势时是肿瘤免疫逃逸的机制之一，Th2细胞或其细胞因子比例升高时可促进肿瘤的生长[17]。因此在治疗肿瘤时，通过调控细胞因子向Th1状态漂移，可促进机体免疫功能的恢复，开启机体抗肿瘤免疫应答，达到缩小肿瘤甚至使肿瘤消失的目的。

在《景岳全书》中有叙述：“凡人之气血犹源泉也，盛则流畅，少则壅滞”，即是说人在气血亏虚之时，血行无力，易致瘀血；《中藏经》有言：“积聚癥瘕杂虫者……皆五脏六腑真气失而邪气并，遂乃生焉”，即意为子宫肌瘤是因脏腑功能失常或元气虚弱而致正虚，又兼邪气作祟而发生；《妇人大全良方》中也有提到“妇人癥痞，由饮食失节，脾胃亏损，邪正相搏，积于腹中，牢不可动，有可证验，故名曰癥”，也是说因饮食失节所指的脾胃虚弱，痰湿内生，正虚邪盛，阻滞气血运行而致瘀阻胞宫则子宫肌瘤发生；在《血证论》中有述：“瘀血在经络脏腑之间，则结为癥瘕”，也说明了子宫肌瘤的发生与瘀血停积密切相关。因此可知子宫肌瘤的基本病因病机为正虚血瘀，其治则为扶正祛瘀。

本研究所用的出自张锡纯先生《医学衷中参西录》的理冲汤，是以扶正祛瘀法治疗子宫肌瘤的代表方，方中三棱、莪术为化瘀血之要药，能够化血理气，善治女子瘀血，并善消冲脉中的瘀血；方中又以黄芪、党参等保护气血，使瘀血去而不伤及气血，而且参、芪得三棱、莪术流通之功更能够使其补而不滞、元气愈旺，而元气旺则更能鼓励三棱、莪术消癥之力，效果更佳；白术、山药能健脾益气，合党参、黄芪补气扶正；天花粉、知母能够解黄芪、白术之热，而且张锡纯老先生善用知母配黄芪，黄芪温补而知母寒润，一阳一阴相互应和；鸡内金不仅能够健脾消食，使其开胃进食进而扶正起衰，此药还能化瘀血而不伤气分，辅助消癥；全方诸药合用能够健脾开胃进食、益气化血和血，共奏扶正行血、祛瘀消癥之功效。

本研究中，经理冲汤干预后，采用MSD 超敏电化学发光技术检测了Th1和Th2细胞中的相关细胞因子。实验结果显示，与正常组比较，模型组小鼠血清中的IL-2和IFN-γ浓度显著降低，而IL-4、IL-5、IL-10的浓度显著升高，提示子宫肌瘤的发生、发展与细胞因子介导的Th1/Th2平衡向Th2状态漂移而导致肿瘤免疫逃逸密切相关。与模型组比较，理冲汤组小鼠血清中的IL-2和IFN-γ浓度显著升高，IL-4、IL-5、IL-10的浓度显著降低，但是阳性药物组中只有IL-2和IFN-γ显著升高，而IL-4、IL-5、IL-10降低的幅度比较差异无统计学意义。而理冲汤可以通过提高Th1细胞因子的表达，降低Th2细胞因子的表达，促使机体免疫向Th1状态漂移，防止子宫肌瘤发生免疫逃逸，抑制其发生、发展，提高机体免疫应答能力。本研究结果显示，理冲汤通过调控Th1、Th2细胞分泌因子的含量水平，影响免疫逃逸，进而发挥抑制子宫肌瘤的作用。