瓜类褪绿黄化病毒快速检测技术的引物筛选与体系优化

王 克, 何艳艳, 张友军, 吴青君, 王少丽

(中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 北京 100081)

烟粉虱Bemisiatabaci属半翅目(Hemiptera)粉虱科(Aleyrodidae)，是世界性重大农业害虫。烟粉虱是由30多个生物型(隐种)组成的复合种(De Barroetal., 2011)，其中B和Q型烟粉虱是入侵我国为害最严重的两个生物型。自入侵我国以来，不同程度地对本地种烟粉虱有种群替代现象(Jiuetal., 2017)，且Q型烟粉虱在我国大部分地区取代了B型烟粉虱成为优势为害生物型(Panetal., 2011)。由于Q型烟粉虱抗药性强、寄主适应性广泛及传播病毒能力高(Ningetal., 2015)，导致这种演替加速了烟粉虱在田间的发生和为害。

烟粉虱以成虫和若虫通过直接刺吸植物汁液、分泌蜜露诱发煤污病，减弱植物光合作用。同时，烟粉虱还可通过传播植物病毒病给作物造成间接为害，带来更为严重的经济损失。目前，烟粉虱传播的病毒种类至少200种(Polstonetal., 2014)，而且新的经由烟粉虱传播的植物病毒仍在不断产生或逐渐被发现(Boykin, 2014)。瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV)是由烟粉虱以半持久性方式特异性传播的一种RNA植物病毒，属于长线形病毒科(Closteroviridae)的毛形病毒属Crinivirus，由两条正义单链 RNA 组成，RNA1 编码病毒复制所需蛋白，RNA2包含与病毒组装、侵染植物、介体传播有关的开放阅读框(刘珊珊, 2013; Shietal., 2016; Sunetal., 2017)，其主要侵染西瓜、甜瓜、黄瓜等葫芦科作物(刘珊珊, 2013)。

CCYV病毒2009年在日本被发现(Gyoutokuetal., 2009)，后逐渐蔓延扩散到其他国家(Wintermanteletal., 2019)。在我国，CCYV最初在浙江宁波、上海地区发现(Guetal., 2011)，随后在河南、海南、北京、山东等其他多个省份陆续被发现并报道(Huangetal., 2010; Guetal., 2011; 张汝楠等, 2012; 刘珊珊等, 2013; 曾蓉等, 2014; 彭斌等, 2017; 杨世安等, 2017; 干射香等, 2019)，给我国瓜类作物健康生产带来了极大的威胁。

CCYV侵染植物初期通常不表现症状，因此快速检测技术的建立对于及时阻止该病毒传播及传播介体防控极为重要。目前已报道的对CCYV检测方法有PCR扩增法(Huangetal., 2010)、双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay, DAS-ELISA)(Kubotaetal., 2011)和环介导等温扩增法(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)(Wangetal., 2014)等。在不同的检测技术中，快速、低成本、易于操作的技术为PCR扩增法。以往研究已报道了不同的CCYV检测引物及其检测方法(Gyoutokuetal., 2009; Huangetal., 2010; Guetal., 2011; Hamedetal., 2011; 袁媛等, 2012; Abrahamianetal., 2013; 刘珊珊等, 2013; Keshavarzetal., 2014; Orfanidouetal., 2014; Wintermanteletal., 2019)，然而在实际检测应用和试验中发现，不同引物对及其配套检测体系的检测结果不尽相同，检测的稳定性不强、重复性不足，部分检测体系由于检测靶标的不同或出现假阳性或假阴性的结果(黎铭等, 2008; 林亚玉等, 2012)。因此，筛选优化可用于介体昆虫烟粉虱和寄主植物的CCYV快速、稳定检测的引物及方法，对于该病毒的早期诊断、识别及介体烟粉虱防控具有重要理论和实践意义。

1 材料与方法

1.1 供试烟粉虱及植物叶片

烟粉虱试虫为采自田间的甜瓜、黄瓜、丝瓜、番茄和茄子等作物上的烟粉虱成虫，经分子生物学技术检测其生物型(隐种)为Q型(褚栋等, 2005)；检测叶片为叶片发黄、疑似携带CCYV的作物叶片。烟粉虱及植物叶片检测样本共计13份，采集时间和地点等相关信息详见表1。

1.2 主要试剂

用于CCYV侵染的根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaciensGV3101菌株(分别带有CCYV RNAl和RNA2的重组表达载体)由河南农业大学施艳教授惠赠。EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司，PCR扩增液2×Es Taq MasterMix和DNA纯化试剂盒DNA Clean-up Kit购自江苏康为世纪生物科技有限公司，标准分子量DL5000 Marker购自TakaRa公司。其他常规试剂均为分析纯。

1.3 引物筛选和条件优化

基于已发表文献，选出14对用于检测CCYV的特异性扩增引物，引物序列及其文献来源等信息见表2。检测引物委托上海生物工程公司合成。

表1 田间烟粉虱成虫及其寄主植物叶片中CCYV的感染状况Table 1 CCYV infection in Bemisia tabaci and the host plant leaves in the field

表2 引物序列及其文献来源Table 2 Primer sequences and the reference sources

采用已鉴定的携带CCYV的根癌农杆菌菌株GV3101制备阳性菌液(Shietal., 2016)，注射黄瓜子叶，具体方法参照文献报道(Shietal., 2016)，30 d后黄瓜植株出现褪绿症状。对显现症状的黄瓜提取叶片总RNA，使用 PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒进行反转录，反转录过程按试剂盒说明书中PrimeScript RT Reagent Kit中20 μL体系进行。采用NanoDropTM2000c分光光度计(美国)测定其浓度，保存反转录的cDNA原液采用CCYV-HSP-Fa和CCYV-HSP-Ra引物(Gyoutokuetal., 2009)进行RCR扩增，扩增体系: 2×Es Taq MasterMix 10 μL, CCYV-HSP-Fa(10 μmol/L)1 μL, CCYV-HSP-Ra(10 μmol/L)1 μL, cDNA模板1 μL。扩增条件: 95℃预变性3 min; 95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 35个循环。扩增条带回收纯化并测序，测序结果经比对确定是目标条带后，将该阳性cDNA作为后续引物筛选的阳性植株模板。

用PCR鉴定的携带CCYV的GV3101根癌农杆菌菌液及其成功侵染的黄瓜叶片的阳性cDNA为模板，对备选的14对引物进行PCR筛选。使用2×Es Taq MasterMix预混体系(北京康为世纪生物科技有限公司)进行PCR扩增。PCR反应体系: 2×Es Taq MasterMix 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, 携带CCYV的GV3101根癌农杆菌菌液或其侵染的黄瓜叶片的阳性cDNA模板1 μL，用ddH2O补足到总体积20 μL。筛选标准为可以同时在阳性菌液和阳性cDNA模板中检测出CCYV的引物对，作为优选引物对。PCR扩增程序: 95℃预变性3 min; 95℃变性30 s, 退火30 s, 72℃延伸60 s, 35个循环; 最后72℃延伸5 min。鉴于PCR扩增采用的是扩增预混Mix体系，因此本研究重点对扩增体系中退火温度进行梯度PCR扩增的优化(Bio-Rad C1000，美国)，设置的温度梯度详见表3，同时设置双蒸水为模板的阴性对照，并从梯度扩增中优选扩增条带明显、特异性强的退火温度作为优选引物扩增体系中的最适退火温度。每对引物设置10次重复。扩增产物送北京擎科生物技术有限公司进行测序以验证。

表3 各引物对梯度温度设置Table 3 Gradient temperatures for different primer pairs

1.4 优选扩增引物的扩增稳定性和灵敏度检测

采用4对优选引物及其对应的扩增体系，以1.3节中携带CCYV的GV3101根癌农杆菌菌液侵染的黄瓜叶片阳性cDNA原液为模板，进行引物及体系的扩增稳定性检测，每对引物扩增设置10次重复。同时，将该cDNA模板原液(1 021.64 ng/μL)按照梯度1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1 024, 2 048, 4 096和8 192倍稀释，然后用1.3节筛选出来的优选引物及其扩增体系进行PCR扩增灵敏度检测。PCR反应体系: 2×Es Taq MasterMix 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, 阳性cDNA模板1 μL, 用ddH2O补足到总体积20 μL。PCR扩增程序: 95℃预变性3 min; 95℃变性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸60 s, 35个循环; 最后72℃延伸5 min。扩增产物上样6 μL进行凝胶电泳检测，确定引物进行PCR扩增时所能检测到的最低的cDNA模板浓度，即检测引物特异性扩增的灵敏度。

1.5 优选引物对田间样本的检测

对采自全国不同地区的13份包括蔬菜和瓜类作物上的疑似感染CCYV的带有症状的叶片和不同作物上的烟粉虱成虫的田间样本(表1)，叶片及烟粉虱成虫的RNA提取、cDNA合成均参照1.3节所述。田间样本的cDNA分别采用筛选的4对优选引物及其对应的最优退火温度进行PCR扩增，扩增体系和扩增程序同1.4节。同时设置双蒸水作为模板的阴性对照。扩增产物取6 μL在凝胶电泳上检测明确田间烟粉虱种群及植物对CCYV的感染状况，由计算公式(阳性样本数/检测总样本数)×100%，计算CCYV的携带率，同时验证所筛选出特异性引物对田间样本检测的适合性和稳定性。

2 结果

2.1 最优引物的筛选及退火温度的优化

PCR扩增结果表明，引物对1, 5, 8, 12和13均可从携带CCYV的GV3101根癌农杆菌菌液及其侵染的黄瓜叶片的阳性cDNA模板中扩增到预期的目标条带；进一步考虑扩增条带的特异性和亮度，选取了引物对5, 8, 12和13扩增的目标条带回收纯化后进行测序，测序结果显示，扩增产物序列为CCYV的DNA序列，扩增产物条带长度分别为709, 1 515, 152和343 bp(图1)。

对筛选获得的4对引物对进行PCR退火温度的优化，引物对5, 8, 12和13的优化退火温度均为56℃。在上述优化温度条件下，各引物对扩增特异性和重复性强(图1)，适合用于CCYV的稳定检测。

2.2 优选引物及扩增条件的稳定性检测

在获得优选引物及其优化的CCYV扩增体系的基础上，对引物及其扩增稳定性进行检测。结果发现，4对引物在其优化的扩增程序下，对携带CCYV的GV3101根癌农杆菌菌液侵染的黄瓜叶片阳性cDNA模板均可实现稳定扩增，且扩增条带特异性强(图2)。

2.3 优选引物对CCYV的扩增灵敏度检测

在获得优化的CCYV扩增体系的基础上，对4对优选引物的扩增灵敏度进行检测，4对优选引物对稀释4 096倍的携带CCYV的GV3101根癌农杆菌菌液侵染的黄瓜叶片阳性cDNA模板仍可扩增到微弱条带(图3)，检测浓度为0. 25 ng/μL，在大于此浓度范围内4对优选引物均可扩增到目标条带，而引物对5, 12和13可以达到检测模板浓度低至0.125 ng/μL(稀释8 192倍)的灵敏度，说明所筛选的4对引物及其对应的检测体系，对最低cDNA模板浓度为0.25 ng/μL的测试样本均可以实现稳定检测。

2.4 田间寄主植物叶片及烟粉虱的CCYV感染率

采集田间的13份疑似感染CCYV的瓜类植物叶片及田间的烟粉虱成虫， 分别采用上述 4对优选引物及其优化的扩增体系进行检测。结果表明，引物对5, 8, 12和13对叶片或烟粉虱成虫样本是否携带CCYV病毒的检测结果是完全一致的；对于扩增到阳性条带的样本，扩增条带同时采用直接测序法确认了其检测结果的准确性和可靠性。结果说明这4对优选引物及其对应的扩增体系均可用于田间CCYV的快速检测。

图1 不同引物对携带CCYV的根癌农杆菌GV3101菌液(A, B, C)及其侵染的黄瓜叶片的阳性cDNA (D, E, F)的PCR扩增Fig. 1 PCR amplifications of bacterial solution of Agrobacterium tumefaciens carrying CCYV (A, B, C) and cDNAs from CCYV-infected cucumber leaves (D, E, F) using different primer pairsM: DNA Marker DL5000; 1-14: 分别为以阳性cDNA为模板用表2中的引物对1～14的扩增产物Amplification products using positive cDNA as the template with primer pairs 1-14 in Table 2, respectively; N: 以双蒸水为模板, 阴性对照H2O as the template (negative control).

图2 4对优选引物对携带CCYV的GV3101根癌农杆菌菌液侵染的黄瓜叶片的阳性cDNA模板的PCR扩增结果Fig. 2 PCR amplification of positive cDNA template from the cucumber leaves infected by Agrobacterium tumefaciens GV3101 carrying CCYV using four primer pairs selectedA-D: 分别为优选引物对5, 8, 12和13(见表2)的PCR扩增结果PCR amplification results with the primer pairs 5, 8, 12, and 13 (see Table 2), respectively. M: DNA Marker DL5000; N: 以双蒸水为模板, 阴性对照 H2O as the template (negative control); 1-10: 以阳性cDNA为模板的10次重复扩增结果10 replicates of amplification with positive cDNA as the template.

图3 4对优选引物对CCYV的PCR扩增灵敏度检测Fig. 3 Sensitivity of PCR amplification of CCYV with four pairs of primers selectedA, B, C, D: 分别为引物对5, 8, 12和13(见表2)的PCR扩增结果PCR amplification results with the primer pairs 5, 8, 12, and 13 (see Table 2), respectively. M: DNA Marker DL5000; N: 以双蒸水为模板, 阴性对照H2O as the template (negative control); 1-14: 分别为携带CCYV的GV3101根癌农杆菌菌液侵染的黄瓜叶片阳性cDNA模板(1 021.64 ng/μL)依次稀释1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1 024, 2 048, 4 096和8 192倍的PCR扩增产物 PCR amplification product of the positive cDNA templates (1 021.64 ng/μL) from cucumber leaves infected by Agrobacterium tumefaciens GV3101 carrying CCYV in 1-, 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 128-, 256-, 512-, 1 024-, 2 048-, 4 096-, and 8 192-fold dilution, respectively.

田间13份样本检测结果表明，2019年在新疆和田、河南武陟、山东寿光、天津武清、陕西安康、海南海口、海南三亚、湖南长沙、北京海淀等地区的9份烟粉虱种群及其疑似带毒叶片中感染了CCYV，田间样本的CCYV阳性率69.23%。5-7月份采集自北京海淀、湖南长沙、江西赣州的烟粉虱及其植株叶片中对CCYV的检测结果为阴性，说明未携带CCYV。除了5月份采集自海南烟粉虱测试种群外，其他检测到CCYV阳性的新疆和田、河南武陟、山东寿光、湖南长沙和北京海淀的烟粉虱及其取食的植株叶片均采集于秋季(表1)，说明除海南地区外，我国华中、华北等北方地区的秋季均为CCYV易感期。

3 讨论

CCYV是由近年来发生的、由烟粉虱半持久性传播的植物病毒病(Guetal., 2011; Lietal., 2016)，逐渐在中国扩散蔓延和为害(王青等, 2018)。植物感染病毒病初期，其症状表现不易识别，需采用分子生物学方法和技术进行检测才能明确其感染情况。在对CCYV的相关研究中，不同文献中采用的引物序列及其扩增条件各不相同，而本文作者在前期预备试验中发现，不同文献中的引物和扩增条件对同一靶标生物的检测结果不一致，分析可能与有些扩增引物的筛选和应用具有靶标生物的特定性有关。例如，大部分基于CCYV病毒的外壳蛋白设计引物对通过根癌农杆菌注射法获得的CCYV阳性植株的早期检测相对困难，但对田间的携毒植物或烟粉虱种群则可成功扩增，且扩增特异性强(数据未示)，可能是由于注射法获得的植株病毒CP蛋白表达含量比较低、不足以成功检测到。因此，筛选获得可以从不同途径感染的CCYV靶标对于该病毒的快速准确发现和防控意义重大。

为了能够实现对根癌农杆菌侵染获得的阳性菌株和田间自然染毒样品的同时稳定扩增，本文建立了基于此的引物筛选标准，筛选获得的4对优选引物(引物对5, 8, 12和13)可用于CCYV的稳定检测，无论是对阳性菌液，或对于田间携毒植株、田间烟粉虱试虫等靶标，均可实现对CCYV的稳定、特异性扩增及快速检测，且能够成功扩增到的最低cDNA模板浓度为0.25 ng/μL，与以往研究中寄生蜂识别鉴定时的最低检测浓度7.812 ng/μL(张锐锐等, 2012)相比，浓度还低至少30倍。本研究所建立的体系的最低检测剂量虽然高于荧光定量PCR技术的检测灵敏度或其他植物病毒种类的检测最低剂量(宋震等, 2017)，但选择这些优选引物中的任何一对及其对应的扩增程序均可以实现对田间植物感染CCYV或其媒介昆虫烟粉虱的携毒性和携毒率检测，进而针对性制定对烟粉虱及其传毒为害的早期防控。

本研究采用优选引物对采集自我国11个地区的共计13份烟粉虱及疑似带毒植株叶片进行检测，发现全年温度较暖的海南地区5月份采集的烟粉虱及其取食的植物叶片均感染了CCYV，这可能与5月份海南温度高、烟粉虱适合发生有关(王原等, 2018)。根据以往报道，2016年海南番茄和黄瓜上的Q型烟粉虱携带CCYV的比例分别达到了65.0%和55.0%(Tangetal., 2017)，说明近年来海南省的CCYV发生率高，生产上需要引起极大重视，做好预防措施。然而，其他采样地区不同，春季瓜类作物上CCYV发生率极低或不发生，而秋季瓜类作物上发生CCYV的感染率很高，说明秋季瓜类作物感染CCYV的风险远远高于春季，这可能与此时烟粉虱种群的高发生数量及其种群密度密切相关(刘珊珊等, 2013)。对于采集于番茄植株上的烟粉虱我们也检测到CCYV病毒，我们猜测可能是烟粉虱从其他寄主植物上带毒。本研究中，新疆和田地区检测的甜瓜上烟粉虱携带有CCYV病毒，结合已发表文献(彭斌等, 2017)，说明新疆和田及吐鲁番地区8-9月份哈密瓜上该病毒病高发，发病率可高达80%。因此，秋季应特别警惕烟粉虱及其传播的CCYV的发生危害，防控措施上需首先降低烟粉虱种群数量。本研究中还发现，山东寿光和海南三亚地区的烟粉虱种群分别采自番茄和茄子作物，但该两种作物上的烟粉虱种群仍被检测到携带CCYV病毒，与以往报道(Tangetal., 2017)类似，说明不感染CCYV的植物上的烟粉虱仍然有携毒风险，如果此类烟粉虱种群扩散到瓜类作物或其他可感毒寄主植物上，由带毒烟粉虱传播导致植物感染病毒病的风险会很高。从瓜类作物种类上来看，目前国内外均有报道该病毒在黄瓜上的侵染(Bananejetal., 2013; 干射香等, 2019)。本研究检测到甜瓜和黄瓜叶片上均有CCYV的感染，而在生产实践及以往报道中，田间甜瓜上出现疑似CCYV感染症状的比例更高(乔宁等, 2015; 彭斌等, 2017)，表明甜瓜可能更易于感染该病毒，但CCYV在甜瓜、西瓜、丝瓜、黄瓜等不同瓜类作物上的感染效率比较研究需要进一步试验和明确。除了瓜类作物，值得关注的是我国海南三亚地区崖城镇和天涯镇的空心莲子草Alternantheraphiloxeroides也检测到感染了CCYV(Tangetal., 2017)，说明该病毒的染毒植物谱可能还在扩大。

我国最初于2011年报道CCYV的发生(Guetal., 2011)，这与Q型烟粉虱被发现大范围、快速取代B型烟粉虱而成为优势种类的报道时间基本一致(Panetal., 2011)。本研究所检测的烟粉虱均为Q型烟粉虱。研究发现，CCYV可以直接或间接地影响烟粉虱的取食偏好性，并且能够增强烟粉虱的取食效率(卢少华等, 2015)；Q型烟粉虱比B型烟粉虱对植物非韧皮部探查和韧皮部唾液分泌增多(Luetal., 2019)，且Q型烟粉虱的传毒能力更强(Luetal., 2017)。因此，目前在我国Q型烟粉虱替代B型烟粉虱而占优势为害种类可能是导致CCYV病毒在我国发生和扩散蔓延的主要原因之一，烟粉虱携毒的早期发现及防控对于阻断CCYV病毒的进一步扩散为害极为重要。