超临界流体制粒在类胡萝卜素微粒中的应用

张亮，韦阳，高彦祥

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

超临界流体（supercritical fluid，SF）是一种温度和压力高于其临界温度（critical temperature，TC）和临界压力（critical pressure，PC）的流体溶剂，在该温度和压力下，它的性质介于液体（如密度和高溶解能力）和气体（如低黏度、高扩散率和高传质速率）之间。许多化合物可以以超临界的状态存在，如二氧化碳、水、丙烷、氮等。其中，超临界二氧化碳（supercritical carbon dioxide，SC-CO2）以价格低廉、超临界状态温和易达到（TC=31.1 ℃，PC=7.38 MPa）等优点成为应用最普遍的超临界流体[1-3]。超临界流体制粒技术就是将超临界流体作为溶剂或抗溶剂，经过一系列的物理反应，制得目标物质微细颗粒的新兴技术。相比于传统的制粒方法（如乳化蒸发法、喷雾干燥法、研磨法、冷冻干燥法），超临界流体制粒技术无需经过剪切、均质等高能处理，也无需使用高温使样品溶解，且制得的微粒粒径小而均匀，从而很大程度上解决了传统方法制备微细颗粒所存在的得率低、不均一、活性差等难题。

类胡萝卜素（carotenoids）是一类对人体有诸多重要生理功能的天然色素的总称，其广泛存在于一些动植物和藻类的黄色、红色或橙色的色素中。类胡萝卜素是由8 个头尾相连的异戊二烯基团组成的化合物，其典型化学结构如图1 所示[4]。

图1 类胡萝卜素的典型化学结构Fig.1 Typical chemical structure of carotenoid

类胡萝卜素种类众多，常见的类胡萝卜素有番茄红素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和虾青素等。类胡萝卜素是食品工业中最常用的食用天然色素，也是功能保健品中最常添加的一类功能因子。但由于其自身理化特性的诸多缺点，如水溶性差、生物利用度低、在光和热条件下易发生降解等，大大制约了它的充分利用[4-5]。而运用超临界流体制粒技术，在温和的操作环境下将其微粒化或制成微胶囊，将显著提高其生物利用度、溶解性和稳定性，同时也将进一步扩大其在食品及其他领域的应用。

1 超临界流体制粒技术种类及原理

根据超临界流体在各反应体系中的作用不同（作为溶剂、抗溶剂、溶质），可将超临界流体制粒技术分为三大类：快速膨胀法（rapid expansion of supercritical solution，RESS）、抗溶剂法（supercritical anti solvent，SAS）、气体过饱和溶液法（particles from gas saturated solutions，PGSS）[6]。

1.1 RESS

RESS 是超临界流体制粒技术中的一个重要分支，适用于与超临界CO2流体互溶的物质的微细化。利用该方法制备类胡萝卜素微粒，通常先调节装置的温度和压力至CO2的超临界态，而后将未经处理的类胡萝卜素样品溶于超临界CO2流体中（由于类胡萝卜素在超临界CO2中溶解度较小，需加入甲醇或乙醇等夹带剂以增强其溶解度），得到饱和溶液后通过特定结构的喷嘴快速喷射到常压膨胀室，再经过旋风分离器收集粒径大小合适的微粒。在此过程中，温度和压力的骤降使得溶质达到极高的过饱和度，进而析出形成大量微核，微核迅速生长形成大小均一的微米甚至纳米级的微粒[4，6-8]。常见的操作装置如图2 所示。

图2 RESS 经典装置图Fig.2 Classic diagram of RESS installation

如今随着技术的不断发展，在RESS 的原有设计基础上，涌现出一些效果更好、能力更加出色的RESS改进版本，如固体共溶剂超临界溶液快速膨胀（rapid expansion of supercritical solution with solid cosolvent，RESS-SC）[9]、超声传质增强式超临界溶液快速膨胀（rapid expansion of supercritical solution with enhanced mass transfer by ultrasonic，RESS-EMU）[10]和超临界溶液快速膨胀至液体溶剂（rapid expansion of supercritical solution into liquid solvents，RESOLV）[11]等。这些改进版本分别从增加溶质在超临界流体中的溶解度、防止微粒之间发生团聚和简化微粒的收集等方面着手，显著改善了RESS 的制粒效果并提高了其制粒能力。

1.2 SAS

SAS 法制备超细微粒最初是由Gallagher 等[12]在1989 年提出的，该法适用在不溶于超临界CO2流体，而溶于有机试剂的物质的微细化。其基本原理也是通过降低溶质在体系中的溶解度来实现微细化的，但具体操作和RESS 相比还有很多不同。制备微粒时，先开启CO2高压泵，往沉降釜中通入一定温度和压力的超临界CO2流体，持续通入一段时间后，再打入一定量的溶剂（乙酸乙酯、二氯甲烷和丙酮等）以获得沉降过程中流动相的均匀稳定体系。之后将类胡萝卜素样品溶解在某一溶剂中形成溶液，由喷头和超临界CO2流体一起喷出，此时超临界CO2流体和溶剂之间相互扩散，使原溶液迅速达到过饱和，从而使溶质从溶液中结晶析出沉降，而后继续通入超临界CO2流体以洗净残留在微粒表面上的有机试剂。洗净后，打开旋风分离器进行微粒的筛选和收集[4，6，13-15]。SAS 的装置如图3所示[14]。

图3 SAS 装置示意图Fig.3 Diagram of SAS installation

根据实际操作的过程不同还可以将SAS 法细分为：气体抗溶剂法（gas anti-solvent，GAS）、气溶胶溶剂萃取体系法（aerosol solvent extraction systems，ASES）、超临界流体提高溶液分散法（solution enhanced dispersion by supercritical fluids，SEDS）[16-18]等等。这些方法都利用了超临界CO2流体与溶剂互溶的特性，使目标物质在溶液中的溶解度降低，进而导致溶质的析出。此外，还有一种以SAS 为基础衍生出的方法，称为超临界流体乳液萃取法（supercritical fluid extraction from an emulsion，SFEE），该制粒方法是传统乳化沉淀法与超临界反溶剂法的结合体，它能制得比SAS 法粒径更小的颗粒，且可以从很大程度上缓解颗粒聚集的问题[19]。

1.3 PGSS

PGSS 法的操作原理和微粒结晶机理与SAS 法极为相似。它是将超临界CO2流体（广义理解为气体）当作溶质溶入液体溶液（熔融的脂类、水溶液、有机溶液等）中形成饱和溶液，溶有超临界CO2流体的饱和溶液经过喷嘴快速释放，由于压力骤降和气体膨胀，目标物质达到过饱和，最终形成微粒。在实际操作中，为了获得性状良好的微粒，防止体系中气-液-固三相平衡遭到破坏，PGSS 一般不适用于在超临界流体中具有较大溶解度的物质颗粒的制备[4，6，20-21]。PGSS 的装置如图 4 所示[22]。

图4 PGSS 装置示意图Fig.4 Diagram of PGSS installation

PGSS 装置由CO2气瓶、气体压缩泵、混合器、喷嘴、流量计、收集室等部件构成。制备类胡萝卜素微粒时，由于类胡萝卜素在高温下极易降解，所以不能将类胡萝卜素样品加热至熔融态，应先将其溶解在有机试剂中，再往溶液中通入超临界CO2流体至溶液饱和，在高压搅拌室的高速搅拌下，经喷头快速喷出形成微粒，该过程与 SAS 处理过程基本相同[6，20，22]。除了使用超临界CO2流体，赵亚冬[23]自主开发了一种超临界N2辅助的PGSS 微粒化技术，通过使用该技术可以顺利制备出月桂酸、肉豆蔻酸和聚乙二醇颗粒。

2 超临界流体制粒技术在制备类胡萝卜素微粒中的应用

近些年来，众多研究者利用超临界流体制粒技术将β-胡萝卜素、叶黄素、虾青素、胭脂素等类胡萝卜素进行造粒或包埋处理，对处理过程中的操作参数（如压力、温度、溶液流速、芯壁比等）进行了优化，并对制得的产品进行了理化性质的表征（如粒径、包埋率、负载率、差示扫描量热、扫描电镜等），详见表1。

可见，RESS 法制得的微粒粒径更小，包埋率更高，且还能制备脂质体、微乳液等其它形式的类胡萝卜素传递体系，但类胡萝卜素在SC-CO2中溶解度较差，加入共溶剂虽可提高其溶解度，但效果仍不是很理想，这就大大限制了RESS 在类胡萝卜素微粒化方面的应用；使用SAS 法制备类胡萝卜素微粒的相关研究较多，大多集中在微胶囊的制备和表征方面。由于SAS 法使用了有机溶剂，因此能够完全的溶解类胡萝卜素，且制得的微粒粒径大小适中，包埋良好，性质稳定，所以用该法制备类胡萝卜素微粒以及制备其它脂溶性功能因子微粒具有广阔的应用前景；PGSS 法和SAS 法原理相似，相关研究集中在操作过程中参数的优化以及微胶囊壁材的选择方面，不难看出，使用PGSS 法制得的微

粒粒径较大，这可能与溶液中溶入过多的SC-CO2有关。

表1 超临界流体制粒技术在类胡萝卜素中的应用Table 1 Application of supercritical fluid granulation technique in carotenoids

3 影响类胡萝卜素微粒制备的主要因素

超临界流体制粒过程中，各种试验参数（如温度、压力、溶液浓度和流速等）都会对制备的微粒的粒径、形貌、包埋率等理化性质造成影响。虽然不同的制粒方法、不同的反应体系对微粒的影响结果不尽相同，但其中某一个因素在特定的环境下所呈现出的结果仍有规律可言。表2 总结了近些年文献中几个主要因素对微粒粒径的影响。

3.1 温度

温度是影响超临界制粒产品的一个重要因素。温度过高，易使类胡萝卜素发生降解，导致产品负载率下降，活性不高；温度过低，类胡萝卜素无法完全溶解在SC-CO2或有机溶剂中，导致产品结晶明显，颗粒较大。它主要影响产品的粒径大小。在操作过程中，一般将温度控制在35 ℃至45 ℃之间。由表2 不难看出，操作温度在合理范围内不断上升，会导致产品粒径增大，这是因为溶液温度升高会导致SC-CO2或有机溶剂密度降低以及溶质的蒸汽压升高，进而导致SC-CO2或有机溶剂溶解强度降低以及溶质的溶解度增加，二者共同作用导致溶液的过饱和度降低，微粒的成核速率降低，生长速率增加，最后导致微粒粒径的增大[4，8，40]。

表2 制粒过程中参数变量对微粒粒径的影响Table 2 Influence of parameter variables on particle size in granulation processes

但也有例外，比如Zhao Lisha 等[26]用RESS 法制备β-胡萝卜素时发现，当操作温度从40 ℃上升到53 ℃时，微粒的平均粒径减小，当操作温度从53 ℃上升到65 ℃时，其平均粒径又增大了，这是因为温度从40 ℃升高53 ℃时，SC-CO2或有机溶剂溶解强度降低导致溶质的溶解度降低占主导作用，从而使溶液的过饱和度增加，获得较高的成核速率，使微粒粒径减小；而当温度继续升高至65 ℃时，溶质的蒸气压升高导致溶质的溶解度增加占主导作用，使溶液过饱和度减小，微粒的生长速率更快，得到了粒径更大的微粒。Hazuki Neromea 等[38]在用SAS 法制备番茄红素微粒时也出现过类似的情况。

3.2 压力

一般情况下，溶液压力的变化主要影响物质在SC-CO2或有机溶剂中溶解度的大小，进而对产品的粒径大小和形貌造成影响。由表2 可知，压力的升高会使微粒粒径减小，这是因为压力升高致使溶液的膨胀度增加，进而使溶液的过饱和度增加，使微粒成核和生长速率同时增加，其中微粒经历的成核阶段时间较长，经历的生长阶段时间较短，故得到了粒径更小的微粒。Guijin Liu 等[32]使用SAS 法制备虾青素微粒，在其它条件维持不变的情况下，将压力从8 MPa 升高到12 MPa，使微粒粒径从 1.23 μm 降低到 954.6 nm，且微粒呈统一的球状排布；Alessia Di 等[39]也使用同样的方法得到了相似的结论。但也有少量的研究结果不存在这样的规律，例如Zhao Lisha 等[26]以及Kahori Kaga 等[34]的研究结果就不符合上述的规律，这可能是因为继续增加压力使活性物质能更快的分散于SC-CO2中，以得到更高的溶解度，进而导致溶液的过饱和度下降，得到粒径较大的颗粒。此外，试验中出现的树枝状、叶片状、不规则状的颗粒可能是由于试验参数、处理条件或喷嘴结构的不同所致。

3.3 SC-CO2和溶液流速

在RESS 和PGSS 中，由于它们的制粒流程与SAS不同，只存在一个最终溶液的流速，且该流速对最终产品的性质影响较小，所以关于溶液流速对它们产品的影响方面研究较少。而在SAS 中，SC-CO2和溶液二者的流速大小关系对最终产品有着不可忽略的影响。Hazuki Neromea 等[38]在其它条件不变的情况下（温度：50 ℃，压力：14 MPa），改变SC-CO2和溶液的流速大小，探究了SC-CO2和溶液二者流速之间的大小关系对番茄红素微粒粒径和形貌的影响。当在高溶液流速和低SC-CO2流速下，形成了平均粒径为116 nm 的粗糙凝集颗粒；在低溶液流速下，得到了平均粒径更小（38 nm）的颗粒。这是因为当SC-CO2流速较大时，使溶液的湍流扰动现象更为明显，溶质与周围环境的混合效果较好，在短时间内使溶液的过饱和度更高，所以得到粒径更小的微粒[38，42-43]。此外，SC-CO2和溶液流速关系也会对微粒的包埋率造成影响。Mezzomo N 等[40]研究了SC-CO2和溶液流速的相互关系对虾青素微胶囊包埋率的影响，结果表明溶液流速越大，包埋效果越差，可能是因为有机溶剂的量比SC-CO2的量大，以至于超过了SC-CO2饱和极限，阻碍颗粒的形成。

3.4 物质浓度

Miguel.F 等[34]在用SAS 法制备番茄红素微粒时，保持温度、压力等条件不变，改变番茄红素浓度大小（125、250、500 mg/L），发现制得的微粒粒径大小分别为7、10、20 μm。这是因为当物质浓度较低时，在液滴膨胀的过程中溶液形成过饱和，使溶质沉淀析出的时间相对较晚，颗粒主要经历的是成核过程，此时形成粒径较小的颗粒；相反，当物质浓度较高时，浓溶液中物质的析出在液滴膨胀过程中出现的时间较早，颗粒不但经历了成核阶段，而且又经历了一段时间的生长期，此时形成的颗粒粒径就相对较大。此外，物质浓度的增加还可能导致微粒包埋率的下降，这可能是因为物质含量的增多减弱了物质与壁材之间的相互作用，导致物质与壁材无法正常联结形成囊状结构[6，35，44]。

3.5 沉淀室长度

沉淀室长度主要对制得颗粒的粒径大小造成影响。F.A.R.Cardoso 等[45]为了更好的通过SAS 法生产微米和纳米粒子，创新性地通过计算流体动力学模型耦合种群平衡方程的方法，结合不同几何形状的沉淀池试验数据，探究了沉淀池长度对PHBV 颗粒尺寸的影响。结果表明沉淀室轴向长度较大、腔径较小的，更容易得到粒径较大的颗粒。这是因为受到喷射流之间的相互作用，颗粒在腔径较小的空间内相互碰撞发生了聚集，且溶液流速越大，聚集现象越明显。此外，轴向长度较大导致颗粒的喷射距离增加，颗粒析出后留给其生长的时间随之增加，也会导致最终颗粒粒径相对较大[8]。Hezave 等[46]在使用RESS 法制备吡罗昔康颗粒时也发现了相同的规律，他们将沉淀室长度由1 cm 增加到 10 cm，发现颗粒粒径也由 5.64 μm 增加至 8.78 μm。

4 存在的问题

虽然超临界流体制粒技术在制备类胡萝卜素微粒方面已取得很多进展，但在实际操作过程中仍存在许多不足。目前RESS 法最大的问题就是如何解决类胡萝卜素在SC-CO2中的溶解度偏低的问题，研究者们对此也提供了许多完善方案，比如加入固体共溶剂和使用超声增溶等等，但效果并不理想，无法满足工业化大生产的需求[6]；SAS 法和PGSS 法原理相似，且二者也在类胡萝卜素微粒制备方面应用较多，但由于当SC-CO2和溶液一起由喷头喷出时，溶液中的有机溶剂并不能完全吸附在SC-CO2中被带出，不仅导致有机溶剂的残留，还会使颗粒聚集在一起，导致喷头堵塞以及颗粒粒径增大，且后续颗粒的收集也比较麻烦[4，6]。

5 展望

基于现阶段所存在的诸多问题，目前超临界CO2流体制粒技术具有以下几个发展趋势：第一，研究不同体系在不同条件下的相行为，各种多组分体系的相平衡可为操作参数（CO2流体浓度、温度、压力等）的设定提供理论参考；第二，探究涂层材料、生物活性物质和SC-CO2之间的相互作用关系，例如由于膨胀作用引起的物质玻璃化转变温度和黏度的降低；第三，深入讨论各方法的微粒结晶机理，这会让我们有能力对重点参数进行修改并及时得到产品性能的定量预估[47-49]。相信随着超临界制粒试验技术和基础理论研究的不断完善，超临界制粒装置的设计和制造均将取得突破性进展。