浓香型白酒发酵旺盛期糟醅中酵母菌菌群研究

谭壹，赵东，陈敏，游玲，王涛，*

（1.西华大学食品与生物工程学院，四川成都610039；2.宜宾学院固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾644007）

在浓香型白酒酿造过程中酵母菌群是一类至关重要的功能微生物[1]，具有影响产酒量、改善产品风味[2]及产生多种活性物质[3]以及能与细菌、霉菌相互作用影响白酒酿造的微生态[4]等多种功能。目前，已经发现的在浓香型白酒酿造过程中的酵母菌有：Wickerhamomyces[5]、Lodderomyces[6]、Clavispora、Issatchenkia、Trichosporon、Saccharomyces[7]、Saccharomycopsis、Zygosaccharomyces、Rhodotorula[8]、Torulopsis[9]、Candida[9]、Hansenula[9-10]、Kluyveromyces[10]、Schizosaccharomyces、Citeromyces[11]、Neatpspora、Brettanomyces[12]、Pachysolen、Porobolomyces、Trulaspora、Dekkera[13]、Geotrichum[14]、Debaryomyces[15]、Malamade、Oosporidium[16]、Torulaspora[17]、Yarrowia[18]、Pichia[19]、Cryptococcus[20]、Naumovozyma[21]、Sporidiobolus[22]31 个属的酵母菌，其中有16 个属的酵母菌株尚未获得纯培养菌株，表明在浓香型白酒酿造中尚有多数种属的酵母菌株资源有待挖掘利用。

宜宾作为浓香型白酒的核心产区，其酵母菌株资源的开发利用也日益受到重视，本研究采用高通量测序及纯培养相结合的方法，研究本产区代表企业五粮液发酵旺盛期糟醅中的酵母群体，一方面初步解析浓香型白酒主发酵过程中的关键酵母种属，另一方面初步建立基于培养组学思想的白酒糟醅酵母菌株资源挖掘方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

五粮液发酵旺盛期糟醅：宜宾五粮液技术中心；赖氨酸琼脂培养、YPD 琼脂培养基、WL 琼脂培养基、低真菌pH 琼脂培养基、孟加拉红琼脂培养基及麦芽汁琼脂培养基（均添加60 g/mL 链霉素）[23]：海博公司；DL-乳酸（分析纯）：盐城华德生物工程有限公司；FastDNA SPIN 试剂盒：上海前尘生物科技有限公司；Yeast DNA 试剂盒：上海易汇生物科技有限公司；PCR扩增试剂盒、引物NL-1 5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'、NL-4 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

高压蒸汽灭菌锅（MLS-3781L-PC）：上海圳宝机电设备有限公司；生化培养箱（SPX-250B）：上海圣科仪器设备有限公司；超净工作台（SW-CJ-2FD）：郑州宏朗仪器设备有限公司；FastPrep-24TM：上海溪拓科学仪器有限公司；小型台式冷冻离心机（5418R）：常州诺基仪器有限公司；Themal Cycler PCR 仪（T-100）：上海珂淮仪器有限公司；电泳仪（DYY-12）：北京新诺立华仪器有限公司；蓝光透射仪（OSE-470）：天根生化（北京）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 取样

采用专用取样器对五粮液发酵窖池中旺盛期糟醅进行多点均匀取样，以取样器插入窖池10 cm 处为上层糟醅，2.7 m 处为下层糟醅。取样时分别于窖池内上下层糟醅同一表面的中心及四周共10 个取样点，每个取样点取100 g 的样品，然后将样品分别装入无菌取样袋中，不冷藏，在1 h 内完成总DNA 提取及纯菌分离。

1.3.2 总DNA 提取及高通量测序

按照FastDNA SPIN 试剂盒的方法提取上、下层新鲜酒糟的总DNA，以NL1、NL4 为引物，PCR 扩增酵母26S rDNA 特征序列[24]，获得聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）产物，并回收纯化，利用 Illumina MiSeq PE300 平台进行高通量测序。

1.3.3 菌株分离纯化

按文献[25]对糟醅混合样品进行稀释涂布。在同种培养基上挑选颜色或形态不同的单菌落到相应的培养基的平板上进行划线纯化培养，待其长出单菌落后进行后期菌落及细胞形态观察合并以及做斜面保藏和30%甘油管保藏在4 ℃冰箱中。

1.3.4 特征序列鉴定

按照E.Z.N.A Yeast DNA 试剂盒的步骤提取纯培养酵母菌株的DNA。以NL1、NL4 为引物扩增酵母菌株26S rDNA 序列。

按照即用PCR 扩增试剂盒在无菌洁净的PCR 管中依次加入：无菌 ddH2O22 μL，2×HiFi-PCR Master 25 μL，DNA 模板 1 μL，引物（10 μmol/L）各 1 μL，终体积 50 μL，离心混匀。

扩增条件：95 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 1 min；65 ℃退火1 min：每一个循环温度降低0.5 ℃；72 ℃延伸 1 min；循环 20 次；94 ℃变性 1 min；55 ℃退火 1 min；72 ℃延伸 1 min；循环 10 次；4 ℃保存。PCR 完后制备1%的琼脂对产物进行鉴定，观察是否有条带，且条带是否在500 bp～600 bp 之间。再将PCR 产物保存好，最后送到上海生物工程技术服务有限公司完成测序。

将测序后的26S rDNA 序列与NCBI 中模式菌株的核酸序列进行同源序列搜索（Blast Search），同时，运用CLUSTAL W 软件比对所有近似物种，使用MEGA 6.0 对序列进行同源性分析，采用邻近连接法（Neghbor-joining）构建系统发育图，确定其系统发育关系的分类地位[26]。

2 结果与分析

2.1 发酵旺盛期糟醅中的酵母区系解析

选择五粮液发酵旺盛期糟醅的上下层为研究对象，进行高通量测序获得五粮液发酵旺盛期糟醅上下层的酵母种属以及相应的丰度（序列条数reads），结果见表1。

由表1 可以看出，在五粮液发酵旺盛期糟醅中共检测出9 个属11 个种的酵母菌群，其中，丰度较高的种属（优势种属）包括Kazachstania exigua（82.97 %）、Saccharomyces cerevisiae（7.89%）、Kazachstania humilis（4.27%）、Pichia kudriavzevii（3.30%）4 个种属，可以看出Kazachstania 酵母是糟醅中的绝对优势种属，其可能是五粮液浓香型白酒发酵旺盛期中的主要功能酵母。上述5 个种之外的其他种属酵母丰度均较低，其合计丰度不到2 %，这些酵母主要是Zygosaccharomyces bailii、Saccharomycopsis fibuligera、Trichosporon ovoides、Debaryomyces hansenii、Naumovozyma castellii、Pichia manshurica、Geotrichum silvicola 7 个种。

表1 发酵旺盛期糟醅中的酵母区系Table 1 Yeast flora in fermented grains at the main stage of fermentation

从酵母群体的空间分布来看，上层糟醅有9 个种属的酵母，下层糟醅有11 个种属的酵母，上层糟醅酵母种属的多样性少于下层糟醅的。其中下层糟醅比上层 糟 醅 多 了 Zygosaccharomyces bailii、Debaryomyces hansenii 这2 个种属的酵母，这可能是由于下层糟醅中的含氧量较低、pH 值较低、温度较高等正好适合这2种酵母种属的生长。总体上发酵旺盛期上、下层糟醅中的酵母区系构成基本一致，但是同一口窖池不同层次糟醅的酵母群体之间还是存在着一定的差异性。

2.2 纯培养酵母菌株的26S DNA序列鉴定

在7 种培养基上获得的纯培养酵母菌株，将在同种培养基上菌落形态及细胞形态都相同的纯培养菌株进行合并，最后这7 种培养基共剩余57 株纯培养酵母菌株，再对菌株的26S rDNA 序列进行测序，最后对测序结果获得的26S DNA 序列进行同源序列搜索后，运用CLUSTAL W 软件比对以及使用MEGA 6.0 进行同源性分析后采用邻近连接法（Neghbor-joining）1000次重复自展构建系统发育图，见图1。

图1 纯培养酵母菌株的系统发育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of yeast isolates based on 26S rDNA sequence

从图1 可以看出，从五粮液发酵旺盛期糟醅中分离到的酵母纯培养菌株共有57 株，分属于3 个属4个种，是 Pichia kudriavzevii、Saccharomyces cerevisiae、Candidaglabrata 和Candidarugosa，分别占总纯培养酵母菌株的 58.9 %、21.4 %、1.8 %、17.9 %，其中 Candida glabrata 在其他浓香型白酒中并没有分离到，这可能是五粮液浓香型白酒中特有的酵母菌株。同时，聚在同一分支上的酵母菌株的26SrDNA 序列尽管几乎完全一致，但其菌株的菌落、细胞形态或气味等方面仍存在不同程度的差异，表明浓香型白酒发酵旺盛期糟醅中的酵母菌株具有明显的种内分化现象，但那些与浓香型白酒酿造密切相关的表观特征（如气味）与特征序列的关联并不明确，因此实际工作中，仅依靠特征序列分析从浓香型白酒糟醅中筛选得到具有优良酿造特性的酵母菌株存在较大困难。

2.3 纯培养方法与免培养方法比较

将高通量测序获得的五粮液发酵旺盛期糟醅酵母群体与在7 种培养基上分离到的57 株纯酵母菌株经过26Sr DNA 测序后，与NCBI 上的模式菌株比对后获得的相似性大于99%的种进行比对，结果见表2。

表2 纯培养酵母种属与高通量种属比较Table 2 Comparison of pure cultured yeast species and highthroughput species

由表2 可以看出，浓香型白酒发酵旺盛期糟醅中的酵母包括 Zygosaccharomyces bailii、Kazachstania exigua、Geotrichum silvicola、Pichia kudriavzevii、Kazachstania exigua humilis 等9 个属13 个种，高通量测序可检测到除Candida glabrata 和 Candida rugosa 外的 11 个种，纯培养法仅分离到 Pichia kudriavzevi、Saccharomyces cerevisiae、Candida glabrata 和 Candida rugosa 4个种，有 80%的酵母种属没有被分离出来，表明高通量测序用于检测浓香型白酒发酵旺盛期糟醅中的酵母群体明显好于纯培养法，这可能主要是由于发酵旺盛期糟醅中优势酵母的生长干扰了非优势酵母的分离，针对这一问题，后续可在高通量测序结果的指导下，充分利用营养及培养条件的组合，设计培养组学方法，分离糟醅中的非优势酵母。一方面可设计选择性更强的培养基来抑制优势种属酵母菌的生长，分离目的种属酵母，如设计以木糖作为唯一碳源并耐高渗透压的培养基分离高度耐盐的Debaryomyces 属酵母[27]；利用高渗透压高酸培养基、并在较高温度下培养，分离耐盐、耐酸及耐高温（可在 40 ℃～50 ℃下生长）的 Kazachstania 属酵母[28]；设计耐酸培养基分离可耐受pH2.0 的Zygosaccharomyces 属酵母[29]；设计以木糖为唯一碳源且可耐受 pH 7.0 的培养基分离 Trichosporon 属酵母[30]，设计耐碱的培养基并在较低温度下培养，分离耐碱（pH 11.0）及耐低温（6 ℃）的 Geotrichum 属酵母[31]。另一方面，针对某些特殊营养需求的酵母，也可通过添加糟醅提取物来满足其营养需求。

3 讨论

同时利用高通量测序技术与纯培养方法解析浓香型白酒发酵旺盛期糟醅中的酵母群体，发现浓香型白酒发酵旺盛期糟醅中的酵母包括Zygosaccharomyces bailii、Saccharomycopsis fibuligera、Trichosporon ovoides、Debaryomyces hansenii、Naumovozyma castellii、Pichia manshurica、Kazachstania exigua、Geotrichum silvicola、Pichia kudriavzevii、Saccharomyces cerevisiae、Candida humilis 等 13 个种属，且 Kazachstania exigua、Pichia kudriavzevii、Saccharomyces cerevisiae、Candida humilis 为优势种。在酱香型白酒酿造过程中Zygosaccharomyces bailii、Saccharomyces cerevisiae 及 Schizosaccharomyce spombe 为优势种属[32]；在清香型白酒酿造过程中 Saccharomycopsis fibuligera、Pichia anomala及Saccharomyces cerevisiae 为优势种属[33]，通过对浓香型白酒与酱香型、清香型白酒酿造过程中的优势酵母种属的比较，发现不同香型的白酒在酿造过程中的优势种属之间存在着一定的差别，而这些差别的优势酵母群体可能在白酒风味形成过程中有重要的贡献，后续还需利用分离到的纯培养菌株，通过单独或混合发酵试验来进一揭示其各种属的不同代谢特征。

另外，尽管使用了7 种各具特色的培养基来分离五粮液发酵旺盛期糟醅中的酵母菌株，获得了57 株形态各不相同的纯培养酵母菌株，但分离到的酵母种属也远远少于高通量测序检测到的种属，一方面说明纯培养法仍存在较大局限，需要在高通量测序结果的指导下进一步优化培养组学方法，另一方面，高通量测序结果无法反映种内的酵母形态及酿造特性多样性，需要通过分离大量纯培养菌株开展进一步研究。