全反式维甲酸增强肺炎链球菌对小鼠的致病性

牛小飞 ， 王宏艳 ， 连朋敬 ， 白 玉 ， 李静云 ， 张子卉 ， 杨俊琦 ， 赵立红 ， 乔 健

(1. 中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 河北工程大学生命科学与食品工程学院 ， 河北 邯郸 056038)

肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae,S.pn)是一种定植于人体鼻咽部的革兰阳性球菌，属于条件性致病菌，可引起肺炎、脑膜炎、菌血症等多种疾病[1]。肺炎链球菌性疾病是全球严重的公共卫生问题之一，也是导致儿童、老年人及免疫缺陷群体发病和死亡的重要原因，全球每年约200万人死于S.pn感染[2]。全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)是维生素A的天然代谢产物，其作为营养补充剂和免疫调节剂在临床上应用十分广泛，是孕妇和儿童补充维生素A，以及治疗儿童麻疹、痤疮、夜盲症、急性早幼粒细胞白血病等的一线用药[3-7]。因此，由于抵抗力下降而诱发S.pn感染的人群与庞大的ATRA使用人群必然会发生重叠。另外，研究表明，ATRA能够通过核受体信号通路调控肺上皮细胞的生长、分化和基因表达及肺部的免疫反应[8]，而肺又是S.pn最主要的靶器官，因此，当ATRA使用人群同时发生S.pn感染时，ATRA的应用是否会影响肺部的免疫反应，从而影响S.pn对机体的致病性是一个亟待解决的科学问题，但目前尚无相关报道。为此，本研究评估了使用不同剂量的ATRA对S.pn致病性的影响，为临床上应用ATRA 的人群在感染S.pn后的风险评估提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 THB培养基、酵母浸粉，均购自青岛海博生物技术有限公司；ATRA、棉籽油，均购自Sigma公司；异氟烷，购自河北一品制药股份有限公司。

1.2 主要仪器 电子天平(YP40001)，上海越平科学仪器有限公司产品；生物安全柜(BSC-1100 II A2)，北京东联哈尔仪器制造有限公司产品；紫外可见分光光度计(T6)，北京普析通用仪器有限责任公司产品。

1.3 试验动物和细菌 6～8周龄，雄性，SPF级BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；S.pn(NCTC7466)，由重庆医科大学惠赠。

1.4 试验方法

1.4.1 试验设计 将152只BALB/c小鼠随机分为8组，分别为空白对照组、ATRA1对照组、ATRA2对照组、ATRA3对照组、感染组、ATRA1感染组、ATRA2感染组、ATRA3感染组，每组19只，其中14只用于检测体重、采食量和存活率，5只用于检测肺系数和肺组织病变。小鼠腹腔注射棉籽油或ATRA 10 d，第11天鼻腔接种PBS或S.pn。空白对照组，注射棉籽油后接种PBS；ATRA1对照组、ATRA2对照组、ATRA3对照组，分别注射1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA后接种PBS；感染组，注射棉籽油后接种S.pn； ATRA1感染组、ATRA2感染组、ATRA3感染组，分别注射1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA后接种S.pn。

1.4.2 ATRA的配制及使用 称取一定量ATRA粉末，将其溶于二甲基亚砜(DMSO)，然后加入棉籽油，将其配制成1、5、10 mg/(kg·bw) 注射液，给小鼠腹腔注射0.2 mL/次，1次/d，连续注射10 d。空白对照组注射棉籽油。

1.4.3S.pn的培养及接种剂量的确定 将S.pn接种于THY培养基(THB培养基中加入0.5%酵母浸粉)，37 ℃培养至对数生长中期，4 ℃、5 000 r/min离心10 min后收集沉淀，PBS洗2次，再用PBS制成细菌悬液。将细菌悬液用PBS稀释成不同浓度后，给小鼠鼻腔接种，根据其临床症状及死亡情况确定接种剂量。本研究中，S.pn的接种剂量为1.6×108CFU/mL，0.1 mL/只，此时小鼠有明显的临床症状但不会死亡。

1.4.4 体重、采食量、存活率变化的测定 体重、采食量和存活率是反映病原致病性的国际通用指标。本研究将小鼠用异氟烷麻醉后鼻腔接种S.pn，连续6 d记录体重、采食量和死亡情况，并根据以下公式计算体重变化率、采食量变化率及存活率：体重变化率=当天体重/初始体重×100%；采食量变化率= 当天采食量/初始采食量×100%；存活率=存活数/总数×100%。

1.4.5 肺系数和肺组织病变检查 肺系数和肺组织病变是反映肺水肿和肺损伤程度的重要指标。在感染后6 h，各组小鼠用过量的异氟烷麻醉使其安乐死，称量体重后剖检，取全肺称重，按以下公式计算肺系数：肺系数=全肺重量(mg)/体重(g)，并将肺组织固定于10%中性福尔马林缓冲液，经脱水、透明、包埋、切片后进行苏木素-伊红(H.E.)染色，显微镜下观察并记录病理变化。

1.5 统计分析 试验结果以“平均数±标准误”方式表示。采用SPSS 20软件对数据进行统计分析，多组间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)法、存活率用log-rank (Mantel-Cox) test法进行差异显著性检验。P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 ATRA对小鼠感染S.pn后体重的影响 由表1可知，1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA对照组与空白对照组相比，体重无显著差异(P>0.05)；感染组与空白对照组相比，体重显著下降(P<0.05)；1 mg/(kg·bw) ATRA感染组与感染组相比，体重无显著差异(P>0.05)；5、10 mg/(kg·bw) ATRA感染组与感染组相比，体重均显著下降(P<0.05)。

表1 ATRA对小鼠感染S. pn后体重的影响Table 1 Effects of ATRA on body weight in mice infected with S. pn

2.2 ATRA对小鼠感染S.pn后采食量的影响 由表2可知，1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA对照组与空白对照组相比，采食量无显著差异(P>0.05)；感染组与空白对照组相比显著下降(P<0.05)；1 mg/(kg·bw) ATRA感染组与感染组相比无显著差异(P>0.05)；5 mg/(kg·bw) ATRA感染组与感染组相比，在感染后第6天显著降低(P<0.05)； 10 mg/(kg·bw) ATRA感染组与感染组相比，在感染后第3、6天显著降低(P<0.05)。

表2 ATRA对小鼠感染S. pn后采食量的影响Table 2 Effects of ATRA on food intake in mice infected with S. pn

2.3 ATRA对小鼠感染S.pn后存活率的影响 由表3可知，1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA对照组、感染组存活率均为100%，与空白对照组相同；1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA感染组存活率分别为100%、85.71%、71.43%，1、5 mg/(kg·bw) ATRA 感染组与感染组相比无显著差异(P>0.05)；10 mg/(kg·bw) ATRA感染组与感染组相比差异显著(P<0.05)。

表3 ATRA对小鼠感染S. pn后存活率的影响Table 3 Effects of ATRA on survival rate in mice infected with S. pn [% (n1/n),n=14]

2.4 ATRA对小鼠感染S.pn后肺系数的影响 感染后6 h小鼠肺系数变化结果如图1所示，1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA对照组与空白对照组相比无显著差异(P>0.05)；感染组与空白对照组相比显著升高(P<0.05)；1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA感染组与感染组相比均无显著差异(P>0.05)。

图1 ATRA对小鼠感染S. pn后肺系数的影响Fig.1 Effects of ATRA on lung coefficient in mice infected with S. pn

2.5 ATRA对小鼠感染S.pn后肺组织病变的影响感染后6 h小鼠肺组织病变如中插彩版图2所示，1、5 mg/(kg·bw) ATRA对照组与空白对照组相比无显著变化，10 mg/(kg·bw) ATRA对照组与空白对照组相比，肺泡膈轻度增厚；感染组与空白对照组相比，肺泡膈轻度增厚，毛细血管轻度充血；1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA感染组与感染组相比，随着ATRA剂量增加，肺组织病变程度逐渐增加，表现为肺泡膈增厚及充血程度增加，炎性细胞增多。

3 讨论

S.pn是导致人类细菌性肺炎最重要的病原。ATRA是维生素A的活性代谢产物，在临床上应用非常广泛。ATRA能够通过核受体信号通路调控肺上皮细胞的生长、分化和基因表达及肺部的免疫反应[8]。研究表明，缺乏维生素A的孟加拉国新生儿，在补充维生素A后死亡率降低[9]；新生儿患S.pn肺炎后，补充维生素A可抑制成年期哮喘的发展[10]。而对于成年后由于各种原因使用ATRA对机体感染S.pn有无影响未见报道。

本研究发现，应用维甲酸可增强S.pn对小鼠的致病性，且随着ATRA剂量的增加，S.pn对小鼠的致病性逐渐增强。具体表现为：与感染组相比，5、10 mg/(kg·bw) ATRA感染组的体重、采食量和存活率均降低；肺系数升高；肺组织病变程度增加；且10 mg/(kg·bw) ATRA感染组比5 mg/(kg·bw) ATRA感染组的严重程度增加。本研究中，维甲酸在S.pn感染中不但没有发挥有利的调节作用，反而使S.pn的致病性增强。目前关于ATRA对呼吸道感染的影响的报道中结果并不一致，营养不良或有更严重疾病的儿童最有可能从ATRA中获益[9]。而给亚临床维生素A缺乏的儿童服用大剂量维生素A后，其急性呼吸道感染的发病率反而增加[11]。另有研究报道，应用高水平的ATRA会导致肺组织的病理损伤，其原因可能是由于ATRA能够使肺组织致敏[12]。综上所述，我们推测在本研究中，使用ATRA后能够增强S.pn对机体的致病性，其原因有可能是连续给予小鼠ATRA后，机体肺组织处于致敏状态，引起肺组织损伤，从而对S.pn的抵抗力降低所致。本研究提示，临床上应用维甲酸的人群在感染S.pn后风险增加，本研究对公共卫生具有重要的指导价值。