鸡血抗菌肽对保育猪生长及其免疫调节的研究

刘 辉 ， 佘锐萍 ， 刘天龙 ， 刘 波

(中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193)

血液抗菌肽是从动物的血红蛋白α或β亚基上裂解而来的片段，具有抗菌等多种活性的水解产物[1]。其分子由15～30个氨基酸残基组成，分子量低(不足10 kDa)。血红蛋白抗菌肽是阳离子抗菌肽，呈现α螺旋构象，在水溶液或十二烷基硫酸钠液体以随机线圈形式存在[1-3]。这些特性决定了它们在微浓度下具有广泛抑制微生物的能力[4-5]。血红蛋白抗菌肽的作用方式是提高细胞膜的通透性[6-7]。

鸡血抗菌肽(Chicken blood antimicrobial peptides，CBAP)属于天然的禽源抗菌肽，是从鸡新鲜血液中提取出大小为3.3 kDa鸡血红蛋白α链片段，被证明有广谱的抗菌活性及家禽免疫调节与抗应激的功能[8]。抗菌肽(AMPs)对哺乳动物免疫力的重要性往往被低估，首先在植物和无脊椎动物中发现抗菌肽具备强大的免疫功能，随着对哺乳动物天然免疫防御系统研究不断深入，AMPs在哺乳动物免疫中的重要作用得到确认。在微生物病原体的刺激下，动物的细胞在感染或损伤局部部位释放AMPs[9]。除了抑制微生物生长外，某些AMPs还可以直接募集白细胞或诱导趋化因子与细胞因子的分泌，从而间接促进单核细胞、巨噬细胞、未成熟树突状细胞和T细胞等效应细胞的募集。募集作用是通过与G蛋白偶联受体介导的，将树突状细胞和T细胞招募到微生物入侵的部位，从而促进细胞免疫反应[10]。AMPs还可以调节动物的适应性免疫。如防御素作为有效的免疫佐剂，通过诱导淋巴因子的产生，促进T细胞依赖性细胞免疫和抗原特异性免疫球蛋白的产生[11]。

本次试验重点探索CBAP对猪的促生长与免疫调节作用影响，为开发绿色无抗促生长添加剂提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与耗材 CBAP是由本实验室按照酶解法从新鲜鸡血中提取所得，pH=6.0±0.5，浓度为300 μg/mL。猪外周淋巴细胞分离试剂盒，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；进口胎牛血清，购自Nobimpex公司；DMEM，购自赛默飞世尔公司；1×PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)，购自Solarbio公司；脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、刀豆蛋白A(Concanavalin A，ConA)、WST-8细胞技术试剂盒，均购自北京钮因华公司；猪补体C3、C4 ELISA试剂盒、猪γ-干扰素ELISA试剂盒，均购自Dogesce公司；猪伪狂犬病(Porcine pseudorabies，PR)gB抗体ELISA检测试剂盒，购自Biochek公司；经典猪瘟(Classical swine fever，CSF)抗体ELISA检测试剂盒，购自美国爱德士公司；猪口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)O型、A型液相阻断ELISA检测试剂盒，均购自金宇保灵生物药品有限公司。

1.2 主要仪器 无菌超净台，美国Labconco公司产品；低速离心机LD5-2，北京医用离心机厂产品；倒置式生物电子显微镜，北京东南仪诚公司产品；紫外分光光度计，Bio-rad公司产品；II级生物安全柜，山东博科生物产业有限公司产品；CO2细胞培养箱，Thermo公司产品；BKQP-100L立式高压蒸汽灭菌器，山东鑫贝西公司产品；电热恒温培养箱，北京陆希科技有限公司产品。

1.3 实验动物 65日龄美系纯种杜洛克猪，购自北京六马集团。

1.4 试验方法

1.4.1 试验时间与地点 2019年8月8日—2019年9月8日，共30 d，试验地点为北京六马集团顺义猪场。

1.4.2 试验设计 根据体重、健康状况等同性原则随机分为2组，每组10头，对照组10头(基础日粮)，CBAP组10头(基础日粮+300 μg/mL、10 mL/d CBAP饮水)。CBAP通过10 mL的注射器(去掉针头)直接注入猪的口腔里，饲料为干湿料，每天早、中、晚各加料1次，饲养试验为30 d。考虑阳光因素，2组试验都有阳面和阴面。基础日粮为六马集团生产加工的保育料，保育猪采用地面栏舍饲养，试验期保持猪舍卫生、消毒。免疫按照猪场管理流程执行，试验猪舍要适当通风，保持猪舍安静。免疫程序见表1。

表1 保育猪免疫程序Table 1 Immunization program for nursery pigs

1.4.3 生长指标的测定 试验过程中，每天观察猪群2～3次，记录保育猪腹泻与死亡情况。(1)日增重：分别在试验的第1天、第30天，早晨7:30左右空腹逐头进行称重，计算出试验期间仔猪的日增重。试验期日增重/头=(试验末栏平均重-试验初栏平均重)/试验天数；(2)平均日采食量：以栏为单位，每栏每天总采食量，连续相加30 d，再求平均值。平均日采食量=采食量/饲养天数；(3)死亡率：30 d内死亡头数/每栏总头数×100%；(4)饲料料肉比=头平均采食量/头平均日增重；(5)腹泻头数：每天查看猪群状态，统计腹泻发病情况与数量。

1.4.4 免疫指标测定 (1)在试验第0、10、20天和第30天各组分别对固定的5头猪(准备屠宰)进行采血，分离血清，标记好，4 ℃保存，一并测定猪瘟(CSF)、狂犬病(PR)、猪口蹄疫(FMD)3种抗体和细胞免疫指标(血清补体C3、C4，γ-干扰素);(2)采集8头猪的脾脏，制作脾淋巴细胞，测定淋巴细胞转化率。抗体检测与脾淋巴细胞提取按照试剂盒说明书步骤完成。

1.5 数据分析 使用Graphpad prism 8.0软件进行显著性差异分析与图表绘制,以P<0.05为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 CBAP对保育猪生长指标的影响 使用CBAP对猪群进行30 d的饲喂，如表2与图1所示，试验末平均体重，CBAP组比对照组多3.42 kg，增重了8.2%，差异显著(n=10，P<0.05)。CBAP组的平均日增重比对照组多88 g/d，提高了13.7%，差异显著(n=10，P<0.05)。CBAP组料肉比与对照组相比下降0.18，下降了10.4%，差异显著(n=10，P<0.05)。 说明CBAP对猪群的生长有很好的促进作用，在采食量大体一致的情况下(1 050 g/d vs 1 103 g/d)， CBAP组有更好的饲料转化率。从控制腹泻角度来说，对照组在试验期间共出现4头腹泻猪只，而CBAP组只有1头，差异显著(n=10，P<0.05)。说明CBAP对控制猪群腹泻效果较为明显，这可能与维持猪群肠道健康有关。

图1 CBAP对保育猪生长指标的影响Fig.1 Effect of CBAP on growth indexes of nursery pigs*：P<0.05，差异显著； 无标记：P>0.05，差异不显著;下同*:P<0.05,the difference was significant; No marker:P>0.05, the difference was not significant. The same as below

表2 CBAP对保育猪生长指标的影响Table 2 Effects of CBAP on growth indexes of nursery pigs

2.2 CBAP对保育猪血清中免疫指标的影响 在试验第0、10、20天和第30天分别采集对照组和CBAP组各5头猪血清，测定补体C3、C4、γ-干扰素。结果见图2。血清补体C3(n=5)的结果见图2A，在第20～30天的CBAP组血清补体C3浓度显著高于对照组(P<0.05)，而在试验开始到20 d，CBAP组与对照组差异不显著(P>0.05)；血清补体C4(n=5)的结果见图2B，与C3结果一致，也是在第20～30天 的CBAP组中的血清补体C4浓度显著高于对照组(P<0.05)。 其他时间效果与对照组不显著(P<0.05)。 γ-干扰素结果如图2C，在第10天及第20天2个时间点CBAP组与对照组差异都不显著(n=5，P>0.05)，而在试验第30天CBAP组猪血清中的γ-干扰素明显高于对照组(P<0.05)。

图2 CBAP对保育猪天然免疫指标的影响Fig.2 Effect of CBAP on innate immune indexes of nursery pigsA：血清补体C3； B：血清补体C4； C：γ-干扰素A:Serum complement C3; B:Serum complement C4; C:Interferon-γ

2.3 CBAP对保育猪脾淋巴细胞增殖的影响 饲喂CBAP 30 d，猪淋巴细胞增殖作用结果如图3所示，由ConA刺激的T淋巴细胞的转化率(n=4)的结果显示，CBAP组要极显著高于对照组(P<0.01)，由LPS刺激的脾B淋巴细胞增殖作用(n=4)显示，CBAP组要极显著高于对照组(P<0.01)，与T淋巴细胞的转化率结果一致。

图3 猪脾淋巴细胞转化试验Fig.3 Lymphocyte transformation test of pig spleen

2.4 CBAP对保育猪体液免疫指标的影响 试验期的第0、10、20天和第30天分别采集对照组和CBAP组各5头猪只血清，检测猪瘟，伪狂犬gB，口蹄疫O型、A型抗体，具体结果如下：CBAP对猪瘟疫苗的效果如中插彩版图4A所示，与对照组相比，CBAP对猪瘟的抗体效价与合格率均无明显改善，差异不显著(n=5，P>0.05)，这可能由于CBAP对活猪瘟疫苗病毒有一定的影响，导致对疫苗抗体效果提高不明显。CBAP对猪伪狂犬疫苗的效果如中插彩版图4B所示，与对照组相比，在第30天gB抗体效价差异显著(n=5，P<0.05)，其他时间段差异不显著。CBAP对伪狂犬灭活苗产生抗体有很好的促进作用。CBAP对猪口蹄疫疫苗O型抗体的效果如中插彩版图4C所示，本场口蹄疫疫苗第1次免疫在60 d，第2次免疫在90 d，饲喂CBAP 30 d后，CBAP组对猪口蹄疫O型抗体滴度有明显的改善作用，在第10天CBAP组抗体滴度极显著高于对照组(n=5，P<0.01);在第20天与第30天采血检查，CBAP组抗体滴度显著高于对照组(n=5，P<0.05)。CBAP对猪口蹄疫疫苗A型抗体的效果如中插彩版图4D所示，试验期间的第10天与第30天CBAP组要明显优于对照组，抗体效价差异极显著(n=5，P<0.01)。第20天CBAP组显著高于对照组，抗体效价差异显著(n=5，P<0.05)。说明CBAP可很好地促进口蹄疫A型抗体产生。

3 讨论

3.1 抗菌肽对猪群的促生长作用 抗生素作为动物饲料促生长添加剂已有50多年的历史。然而，饲料中抗生素增加动物机体产生耐药性机会，天然抗菌肽不但可以促进动物生长，提高各项免疫指标，且作用稳定，安全可靠，是理想的促生长添加剂替代品。本次试验选用大保育猪作为研究应用对象，体重在20 kg以上，每天每头饲喂300 μg/mL、10 mL/d，经过1个月饲喂周期，与对照组相比，日增重提高了13.7%，料肉比下降了10.4%，腹泻率下降了30%。表现出较好的促生长和抗腹泻效果。

3.2 抗菌肽对猪群的免疫促进作用 抗菌肽的免疫增强活性一直是研究的热点之一，其独有的双重平衡机体特性，可以直接通过抗菌活性和刺激固有免疫功能(炎症、伤口修复和适应性免疫系统的调节)保护宿主免受潜在有害病原体的侵害。同时，还保护机体免受过度炎症反应的有害影响。本试验从下面两个方面讨论抗菌肽与免疫的关系。

3.2.1 抗菌肽与天然免疫 补体(Complement,C)是血浆蛋白的正常组成成分，存在于人与动物血浆中一组无活性的分泌蛋白和膜结合蛋白前体。激活补体系统过程中，会产生多种活性分子参与机体的抗感染免疫，调节细胞与体液免疫效应，介导炎症反应。血清中补体C3、C4含量反映机体的免疫水平。王静(2007年)研究发现，饲喂抗菌肽粗提的肉鸡，21日龄血清补体 C3、C4含量要明显高于对照组[12]。本试验使用CBAP饲喂猪群30 d后发现，在试验第10天时，CBAP组猪的血清补体C3、C4含量逐步要高于对照组，在第20～30天，试验组的C3、C4含量要显著高于对照组，这说明抗菌肽对补体系统有很好的促进作用，这与王静的研究结果相一致。γ-干扰素由活化T细胞和自然杀伤细胞产生，具有较强的免疫调节功能。它可以调节T、B淋巴细胞的功能，小剂量时起促进作用，大剂量却表现为抑制。本试验对饲喂CBAP的猪群血清进行γ-干扰素检查发现，对照组相比，饲喂CBAP组在第30天γ-干扰素明显高于对照组。脾淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞与体液免疫水平，本次试验饲喂30 d CBAP后，各组取4头猪的脾脏，分离淋巴细胞，用ConA作为T淋巴细胞有丝分裂原，用LPS作为B淋巴细胞有丝分裂原，刺激测定细胞转化率结果发现，对照组相比，CBAP组的对T、B淋巴细胞转化率均极显著地提高(P<0.01)。说明CBAP可以有效缓解动物的免疫抑制。

3.2.2 抗菌肽与体液免疫 AMPs不但可以调节先天性免疫，而且对适应性免疫也有很好的促进作用。将卵清蛋白(OVA)与α-防御素HNP1-3联合应用于小鼠，与单独使用OVA相比，联合使用可以增加OVA的IgG抗体水平[13]。蜂毒肽(Melittin)是一种24个氨基酸的多肽，存在于蜂毒中，具有很强的疫苗佐剂活性。使用这种肽结合破伤风类毒素(TT)或白喉类毒素(DT)抗原鼻腔免疫小鼠，血清抗TT和抗DT IgG明显高于单独接种抗原小鼠[14]。这可能是由于AMPs通过诱导共刺激分子促进IDCs的成熟，在APC与抗原接触时来调节淋巴细胞反应，改变细胞因子的表达，导致抗原摄取增加。从而促进更有效的抗原提呈及后续更强大的T细胞活化。但要考虑抗菌肽自身的免疫原性，因此建议使用短肽(<15氨基酸)作为免疫佐剂。本次试验发现CBAP对猪瘟抗体效果不显著，这可能是由于猪瘟是弱毒疫苗，有囊膜，CBAP对其也有一定的杀灭或者抑制体内增殖作用。因此影响了其抗体的产生，但CBAP也对免疫有一定促进作用，最后结果表现出差异不显著。本试验中猪伪狂犬第2次免疫采用的是灭活疫苗，CBAP对其抗体的产生有明显的促进作用。口蹄疫O、A抗体与伪狂犬一致，在抗体效价上，CBAP组要明显优于对照组(P<0.05)。根据本次试验发现，CBAP对弱毒苗效果不是很理想，但对灭活苗的效果比较好。