安卡拉病毒PCR检测方法的建立

李乔斌 ， 张云丹 ， 何 玲 ， 岳 筠 ， 李 梅 ， 谢晓东 ， 程振涛,3

(1.贵州大学动物科学学院 ， 贵州贵阳550025 ； 2.贵州省动物疫病预防控制中心 ， 贵州贵阳550008 ； 3.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室 ， 贵州贵阳550025)

心包积液-肝炎综合征(Hydropericardium-hepatitis syndrome,HHS)最早发现于巴基斯坦安卡拉地区，故又称为安卡拉病，该病的病原是禽腺病毒，而引起此病症状的属于Ⅰ群禽腺病毒[1]，该病毒主要感染鸡群。感染病例临床病理特征主要为心包积液和肝炎，因此，也称为HHS[2]。该病先后流行于巴基斯坦、印度、韩国等亚洲地区和秘鲁、智利、墨西哥等美洲地区。自2015年，该病在中国多省份暴发流行[3-4]，2016年以来贵州省也先后有多地出现疑似病例[5]。该病发病急，传播速度快，病死率高，死亡率为30%～80%，临床上易与其他禽类免疫性疾病产生协同作用，引起混合感染[6]，给该病检测带来困难，因此，建立一种快速、高效、特异的检测方法显得十分必要。本试验基于Ⅰ群禽腺病毒血清4型 (FAdV-4)hexon基因，构建可快速检测安卡拉病毒核酸的检测方法，将为该病原流行病学研究、致病机理研究、预警预报提供关键技术。

1 材料与方法

1.1 毒株与样本 FAdV-4标准毒株，由贵州福斯特生物科技有限公司提供。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、鸡痘病毒(Fowl pox virus，FPV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)和传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)等疫苗，均购自扬州威克生物科技有限公司；减蛋综合征病毒(Egg drop syndrome virus,EDSV)和H9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)等疫苗，均由贵州福斯特生物科技有限公司提供。临床疑似HHS病例组织样本(肝脏)材料采集自贵州省某养鸡场。

1.2 试剂 RNA/DNA提取通用试剂盒、2×TaqPCR Master Mix、DL-2 000 DNA Marker，均购自天根生化科技(北京)有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 引物设计与合成 根据安卡拉病毒主要结构蛋白六邻体(Hexon)基因序列，应用Primer Pemier 5.0软件设计合成1对引物FAdV-4 F/R，引物序列见表1，预期扩增片段大小为295 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物稀释成浓度为10 pmol/μL，于-20 ℃保存备用。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 FAdV-4 PCR检测方法体系构建 初步建立FAdV-4 PCR检测方法25 μL反应体系：DNA模板2 μL，PCR Mix 12.5 μL，引物FAdV-4-F/R各1 μL，ddH2O补足至25 μL。PCR反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳观察。

1.5 PCR检测方法反应条件的优化 以提取的FAdV-4 DNA为模板，建立25 μL PCR反应体系，分别对模板浓度、退火温度进行优化。模板浓度设定：DNA模板质量浓度分别为2.19×10-2、4.38×10-2、8.78×10-2g/L和1.76×10-1g/L；退火温度梯度为：56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃ 和64 ℃。根据上述模板浓度和退火温度的设计方案，确定最佳PCR反应条件。

1.6 PCR检测方法的性能评估

1.6.1 敏感性检测 将提取的FAdV-4 DNA模板采用核酸蛋白测定仪测定其初始浓度，按10倍梯度倍比稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6系列浓度梯度，应用构建的PCR方法最佳反应条件进行目的基因扩增，扩增产物于1.2%的琼脂凝胶电泳观察结果，以出现DNA电泳条带为判定标准，评估该方法的敏感性。

1.6.2 特异性检测 分别提取1.1中的疫苗株模板应用建立的PCR方法进行目的基因扩增，同时设FAdV-4为阳性对照，去离子水为阴性对照。扩增产物于1.2%的琼脂凝胶电泳观察结果，评估该方法的特异性。

1.6.3 临床应用性检测 取10份临床疑似病例肝脏组织提取DNA样本，应用构建的PCR方法进行目的基因扩增，同时设FAdV-4标准毒株样本为阳性对照，去离子水为阴性对照。扩增产物于1.2%的琼脂凝胶电泳观察结果，评估该方法的临床应用效果。

2 结果

2.1 PCR方法体系的构建 以初步建立的25 μL普通PCR反应体系和反应条件对目的基因进行PCR扩增，PCR产物电泳结果见图1。由图1可见，所建立的PCR反应体系能扩增出大约295 bp的目的基因条带，与预期相符。

图1 FAdV-4样本PCR检测Fig.1 Detection of FAdV-4 samples by PCRM：DL-2 000 DNA marker； 1～3：FAdV-4样本； 4：阴性对照M：DL-2 000 DNA marker； 1～3：FAdV-4 samples； 4：Negative control

2.2 PCR反应条件的优化 由图2可知，当模板质量浓度稀释为2.19×10-2g/L时，扩增条带很弱，而当浓度为4.38×10-2g/L时扩增条带最明显，因此，最佳模板质量浓度确定为4.38×10-2g/L。由图3可知，在退火温度为58 ℃时，扩增条带最亮，随着温度升高，条带减弱，因此最终确定58 ℃为最佳退火温度。

图2 模板质量浓度的优化Fig.2 Optimized of template concentrationM：DL-2 000 DNA marker； 1～4：模板浓度分别为2.19×10-2、4.38×10-2、8.78×10-2 g/L和1.76×10-1g/LM：DL-2 000 DNA marker； 1～4：The concentrations of templates are 2.19×10-2, 4.38×10-2, 8.78×10-2 g/L and 1.76×10-1 g/L

图3 退火温度的优化Fig. 3 Optimization of annealing temperatureM：DL-2 000 DNA marker； 1～5：退火温度分别为56、58、60、62 ℃和64 ℃M：DL-2 000 DNA marker； 1～5: Annealing temperatures are56,58,60,62 ℃ and 64 ℃

2.3 PCR方法性能评估

2.3.1 PCR方法敏感性 经核酸蛋白测定仪测定FAdV-4模板浓度为4.38×10-2g/L，以此模板浓度稀释至10-6倍，应用最佳PCR反应体系和反应条件对10倍倍比稀释的系列浓度DNA样本进行检测，结果见图4。由图4可见，在稀释倍数10-4时还出现微弱的扩增条带，至10-5稀释度时，无明显扩增条带。因此，建立的PCR方法最低检测FAdV-4病毒核酸浓度为4.38×10-6g/L。

图4 敏感性检测Fig.4 Sensitive detectionM: DL-2 000 DNA marker； 1～7: 模板DNA稀释倍数分别为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6； 8:阴性对照M：DL-2 000 DNA marker； 1～7：Template dilutions are 100,10-1,10-2,10-3,10-4,10-5 and 10-6； 8:Negative control

2.3.2 PCR方法特异性 由图5可见，FAdV-4核酸样本扩增出与预期大小相符的条带，而其他6种病毒核酸样本均无基因扩增条带，表明建立的PCR方法有较好的特异性。

图5 特异性检测Fig. 5 Specificity detectionM：DL-2 000 DNA marker； 1：血清4型禽腺病毒； 2：新城疫病毒； 3：鸡痘病毒； 4：传染性支气管炎病毒； 5：鸡传染性法氏囊病病毒； 6：减蛋综合征病毒； 7：H9亚型禽流感病毒M：DL-2 000 DNA marker； 1：FAdV-4; 2：NDV; 3：FPV; 4：IBV; 5：IBDV; 6：EDSV; 7：AIV H9 subtype

2.3.3 临床样本检测 取10份临床疑似病例肝脏组织提取DNA样本，评估所建PCR方法的临床应用性，结果见图6。由图6可见，除阳性对照外，10份样本中有6份样本扩增出与预期相符的目的条带，检测阳性率为60%(6/10)，说明本试验建立的PCR方法可用于FAdV-4临床样本检测。

图6 临床样本检测Fig.6 Detection of clinical samplesM： DL-2 000 DNA marker； +：阳性对照;1～10：临床样本； -：阴性对照M：DL-2 000 DNA marker； +：Positive control； 1～10：Clinical samples； -：Negative control

3 讨论

安卡拉病毒属于腺病毒科禽腺病毒属(I亚群禽腺病毒)禽腺病毒C种血清4型(FAdV-4)，该病毒在病毒粒子结构形态、培养特性、理化特性等方面无法有效与其他禽腺病毒鉴别。禽腺病毒分为3个群(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，5个种 (A～E) 和12个血清型[7]。不同血清型禽腺病毒间具有一定的免疫交叉反应，但不足以产生交叉保护。因此要实现各血清型禽腺病毒所致疫病的及时预警和有效防控，仍需对各种禽腺病毒类型作出及时有效的检测。安卡拉病毒感染主要引起心包积液和肝炎，还可引起蛋鸡产蛋下降。临床上安卡拉病毒病易与鸡包涵体肝炎病混淆，且易与禽白血病、传染性法氏囊病、大肠杆菌病等混合感染[8-9]，这些因素导致难以基于临床症状对该病作出确切性诊断，因此，高效、快捷的实验室检测方法的建立对实现该病的早发现、早防控起到了关键作用[10]。鉴于本病在贵州省的流行现状，本文建立了可用于FAdV-4快速检测、组织嗜性、病毒含量等研究的检测方法，为安卡拉病毒病的诊断、研究提供了科学依据。

目前，可用于FAdV-4的检测方法有血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等血清学试验[11]。这些方法快速、操作简单，但易出现假阳性和交叉反应。基于PCR病原核酸检测的分子生物学方法具有快速、灵敏等优点，包括PCR检测技术、LAMP、q-PCR等，这些技术各有优缺点[12-13]，均可用于检测FAdV-4。目前，安卡拉病毒检测尚无技术规范，但有研究针对安卡拉病毒Penton基因建立PCR检测方法[14]，而本试验基于安卡拉病毒Hexon基因，选择保守区域建立PCR检测技术，性能评价显示具有良好的特异性、敏感性，该方法不仅可用于病例的快速诊断，也可基于纤突蛋白的致病相关性开展病毒组织嗜性研究。PCR检测技术因具有特异性、敏感性，在医药卫生、农业科学和生物学等领域得到广泛应用[15]，本文建立的安卡拉病毒PCR检测方法性能分析也具有较好的敏感性，最低检测FAdV-4病毒核酸浓度为4.38×10-6g/L,根据DNA拷贝数的计算公式，可得灵敏度为2.03×105拷贝/μL，较Brownie等[16]建立的PCR检测灵敏度103～104拷贝/μL更敏感。本文在设计引物时，通过对不同血清型禽腺病毒Hexon基因进行序列比对，选择了609～904 bp保守区域片段，具有血清型特异性，能有效区分不同禽腺病毒血清型，保障所建方法的特异性[17]。