类叶牡丹果实超临界提取物成分分析及其抗菌活性研究

朱丹丹，张午寅，程伟，刘莹，吕春艳

(哈尔滨商业大学药学院，黑龙江省预防与治疗老年性疾病药物研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076)

类叶牡丹(CaulophyllumrobustumMaxim.)为小檗科红毛七属植物，多年生草本。黑龙江、吉林、辽宁等东北亚区均有分布，野生资源以黑龙江省最为丰富，并可以人工栽培[1]。据民间验方记载，类叶牡丹对类风湿、胃痛及妇科疾病等均有较好的疗效[2]。国外将其同属植物兰籽类叶牡丹(CaulophyllumthalictroidesMaxim.)用于治疗腹痛、腹泻、胃痛及妇科分娩疼痛，并在北美曾经作为保健品服用,该植物含有的小极性脂溶性化合物具有抗炎镇痛作用，这与类叶牡丹在中国民间传统用药的临床实践是一致的。黑龙江类叶牡丹果实为浆果，其小极性脂溶性成分有其生源特征,因此笔者将类叶牡丹果实采用超临界-CO2(SFE-CO2)提取其脂溶性成分，得到棕黄色油状脂溶性提取物，再借助气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对其化学成分进行了分析。利用微量二倍连续梯度稀释法测定提取物的最小抑菌浓度(MIC),平板转种法测定其最小杀菌浓度(MBC)。

1 仪器及试剂

类叶牡丹果实样品采自黑龙江省绥棱林业局，经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定为CaulophyllumrobustumMaxim fruit，即类叶牡丹果实。

SFT-110XW型超临界CO2流体萃取仪(赛普泰克有限公司,中国)。GC-MS联用色谱仪采用Aglient6890/5973型GC-MS-DS联用仪(安捷伦科技有限公司，美国)。

2 实验

2.1 提取

将干燥的类叶牡丹果实200 g碾碎，投入容量1 kg的萃取釜中, 萃取压力设定为40 MPa，二氧化碳流速为10 kg/h连续萃取2 h，收集萃取液，得到棕黄色油状物，即类叶牡丹果实脂溶性成分，产率为1.86%(w/w)。

2.2 GC-MS分析

气相色谱条件：SE-54石英毛细管柱，0.25 mm×30 m;柱前压8 psi,柱温60～280 ℃，程序升温5 ℃/min；进样口温度：300 ℃，分流比：60,气化室温度：280 ℃；载气为高纯氦，流速1 mL/min;进样量1.0 μL。

质谱及分析条件： EI离子源, 电子能量:70 eV,扫描速度:1 amu/sec,扫描幅度:12～500 amu,离子温度:230 ℃,标准图谱库NIST。

应用GC-MS中的DS数据系统对类叶牡丹经超临界提取的脂溶性成分进行分析，检索结果结合相关文献并与DS处理系统提供的标准图谱库进行核对，人工解析鉴定图谱，确定脂溶性成分的化学组成。色谱峰由DS数据处理系统处理，同时根据峰面积归一法进行相对含量分析。

2.3 抗菌实验

抗菌实验菌株为金黄葡萄球菌、伤寒沙门氏菌等共4种。

实验菌液配置:MH肉汤用于接种细菌，置普通培养箱(37 ℃，24 h)培养，比浊法计数。培养液被调配成106CFU/mL，使用肉汤培养基和普通琼脂平板培养基，采用微量二倍连续梯度稀释法测定MIC，平板转种法测定MBC[3]。

MIC的测定:将类叶牡丹果实超临界提取物溶于含5%Tween 80的肉汤，进行二倍连续梯度稀释，将各浓度样品液分别加到96孔培养板，0.15 mL/孔。再依次加入浓度为106CFU/mL的实验菌液50 μL/孔。同时设立对照细菌孔。在湿盒内于普通培养箱(37 ℃，24 h)培养，观察，无细菌生长孔的最小药物浓度为最小抑菌浓度(MIC)。

MBC的测定:将细菌未生长孔(≥MIC)的培养物逐个用无菌生理盐水稀释20倍，并吸取0.05 mL逐个点种于琼脂平板，在普通培养箱(37 ℃，24 h)培养，无细菌生长接种区域所对应的最小药物浓度为最小杀菌浓度(MBC)。

阴性对照为空白培养基，0.5 mg/mL庆大霉素为阳性对照。

3 结果与讨论

3.1 超临界提取物的GC-MS分析

依据据类叶牡丹果实超临界提取脂溶性成分的GC-MS分析,总离子流图给出51个峰，经过DS处理系统提供的标准图谱库核对与计算机检索，图谱人工解析，相关文献印证，鉴定出40个化合物，占挥发油总量的94.24%。利用归一法测定了各物质的相对百分含量。所得的总离子图见图1，类叶牡丹果实脂溶性成分检索分析及相对含量结果见表1。

表1中结果显示，类叶牡丹果实经超临界-CO2提取的脂溶性成分中脂肪酸酯类占40.4%,其中甲酸异戊酯(isopentyl formate)相对含量最高, 达到了23.536%，脂肪酸类化合物占35.570%，烷烃占2.962%,脂肪醇占比较小，尚含醚、酮类、烯烃类、生物碱类和芳香族化合物。经分析该脂溶性成分中不但含有已经报道的生物碱N-Methylcytisine，还首次在该植物中发现了五味子醇甲(Schizandrol)等化合物。

表1 类叶牡丹脂果实溶性成分的化学组成及相对含量

图1超临界-CO2提取类叶牡丹果实脂溶性成分总离子流图

3.2 类叶牡丹果实超临界提取物体外抗菌活性

类叶牡丹果实超临界提取物对4种标准菌株的MIC和MBC值如表2所示，从表中结果可以看出类叶牡丹果实超临界提取物对实验所选取的4种实验菌株均有抑制和灭活作用。

表2 类叶牡丹果实超临界提取物对标准菌株的MIC和MBC值(g/L)

4 小结

根据以往的文献报道，类叶牡丹果实脂溶性成分应该是含有小极性的生物碱、皂苷、甾醇，甚至还有芳香类成分，但由于本文采用超临界-CO2提取方法及GC-MS分析方法，可能影响了一些比如小极性皂苷的检出，但文献报道的N-Methylcytisine和胺类化合物均得以进行合理的分析检出，这为该植物通过常规手段提取分离不便分离鉴定成分的检识提供了一种选择[4-8]。

类叶牡丹果实超临界提取物对大肠杆菌86953株和金黄色葡萄球菌ATCC25925的MIC值是0.8 g/L和0.12 g/L，表明类叶牡丹果实超临界提取物对大肠杆菌86953株和金黄色葡萄球菌ATCC25925株有比较显著的抑制作用；类叶牡丹果实超临界提取物对枯草芽孢杆菌CMCC63501株和伤寒沙门菌54721株的MIC值分别是0.4、0.6 g/L，表明类叶牡丹果实超临界提取物对此两种细菌也有明显的抑制作用。类叶牡丹果实超临界提取物对大肠杆菌86953株和金黄色葡萄球菌ATCC25925株的MBC值是1.6、0.24 g/L，表明类叶牡丹果实超临界提取物对大肠杆菌有灭杀作用，对金黄色葡萄球菌有显著的杀灭作用；类叶牡丹果实超临界提取物对枯草芽孢杆菌CMCC63501株和伤寒沙门菌54 721株的的MBC值分别是0.8、1.2 g/L，表明类叶牡丹果实超临界提取物对这两种细菌也有明显的杀灭作用。可见,类叶牡丹果实超临界提取物对选用的4种菌株均有杀灭作用,且类叶牡丹果实超临界提取物对金黄色葡萄球菌ATCC25925株的抑制及灭活作用比较显著。