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通络生骨胶囊对骨关节炎的治疗作用及其分子机制研究

2020-03-30李译林惠湦陈妮刘礼飞

中医药信息 2020年1期
关键词:通络骨关节炎软骨

李译,林惠湦,陈妮,刘礼飞

(浙江海正药业股份有限公司,浙江 台州 318000)

骨关节炎(OA)是由于外界的多种因素(如肥胖、机械损伤、炎症等)引起的关节软骨纤维化,软骨层脱失以及软骨下骨增生形成骨赘,以关节疼痛、行动受限为主要临床症状的一种退行性疾病[1]。对于OA具体发病机制的研究目前还尚不明确,但越来越多的研究发现软骨细胞的活率、炎症的严重程度以及软骨细胞的抗损伤能力均与疾病的发生发展具有密切联系。通过促进软骨细胞的增殖,降低炎症因子的表达,抑制过度炎症对软骨细胞损伤作用开发的药物,均在临床上取得了一定的治疗效果[2]。通络生骨胶囊是目前市场上用于治疗股骨头坏死的中药单方,其主要成分是木豆叶水提物,前期的研究中发现通络生骨胶囊具有活血健骨、解毒消肿、化瘀止痛,降低氧化损伤的作用[3]。袁捷等[4]研究发现,木豆叶可降低木瓜蛋白酶诱导的兔骨关节炎症状,其含药血清可以促进软骨细胞增殖和细胞内蛋白合成,提示其或可作为治疗骨关节炎的中药进行开发。本实验观察通络生骨胶囊对碘乙酸诱导的SD大鼠的骨关节炎模型进行干预,探讨其对炎症因子以及基质金属蛋白酶的表达影响。进一步通过通络生骨胶囊干预IL-1β诱导的体外软骨损伤模型,观察干预后对Wnt/β-catenin和Nrf2/HO-1信号通路的影响,从中探讨通络生骨胶囊治疗骨关节炎的作用和分子机制。

1 材料和方法

1.1 动物与材料

清洁级6~8周龄SD大鼠,由北京维通利华提供,许可证号:SCXK(浙)2018-0001,动物质量合格证编号:11400700369590。动物饲养于聚丙烯塑料盒内,每笼不多于5只,动物房空气流通良好并有环境监控装置,温度20 ℃~25 ℃,相对湿度40%~70%。日光灯照明,12 h明暗交替。笼具大小和动物管理符合浙江省实验动物使用和管理指导原则。

SW1353细胞(ATCC);通络生骨胶囊(原料药由海正药业股份有限公司生产,批号为J31709061);RPMI 1640培养基、胎牛血清、HEPES、0.25% Trypsin-EDTA(美国Gibco公司);TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技术有限公司);SuperReal PreMix Color (SYBR Green)[天根生化科技(北京)有限公司];IL-1β(R&D Systems);细胞活性检测试剂盒(美国普洛麦格公司);Trizol(赛默飞世尔);c-Fos、MMP-13、β-catenin(CST);Tubulin(Sigma)。

1.2 引物序列

大鼠MMP-13上游引物:TGAC TATG CGTG GCTG GAA,下游引物:AAGC TGAA ATCT TGCC TTGG A。人Wnt4a上游引物:GCTC TGAC AACA TCGC CTAC,下游引物:TCGC CAGC ACGT CTTT AC。人β-catenin上游引物:AGC TCC CTC GCG GTT CAT,下游引物:GGG CGG CAC CTT CCT ACT TC。人GSK-3β上游引物:CCGA CTAA CACC ACTG GAAG CT,下游引物:AGGA TGGT AGCC AGAG GTGG AT。人 MMP-13上游引物:GCCT GCAC CACG GACG GTCG CTCC,下游引物:GAGG TGCC GGAT GCCA TTCA CGTC。人 ADAMTS4上游引物:ATGG CTAT GGGC ACTG TCTC,下游引物:GTGT TTGG TCTG GCAC ATGG。人 Nrf2上游引物:TCCA GTCA GAAA CCAG TGGA T,下游引物:GAAT GTCT GCGC CAAA AGCT G。人GCLC上游引物:ATGG AGGT GCAA TTAA CAGA C,下游引物:CTGC ATTG CCAC CTTT GCA。人NQO-1上游引物:CCTA GTTC GTCA TGGG TGTG AACC A,下游引物:GCCA GTAG AGGC AGGG ATGA TGTT C。大鼠β-actin上游引物:CCCA TCTA TGAG GGTT ACGC,下游引物:TTTA ATGT CACG CACG ATTT C。人GAPDH上游引物:ATGG CCTT CCGT GTTC CTAC C,下游引物:GCCC AAGA TGCC CTTC AGTG。

1.3 OA模型构建与检测

大鼠称重,根据体质量腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.33 mL/100 g),仰卧位固定后,剪去右侧膝关节处毛发,碘伏消毒,采用1 mL注射器对OA组大鼠右侧膝关节注射MIA生理盐水溶液(每只大鼠注射40 μL,含MIA 3 mg,过滤除菌),对照组注射生理盐水,注射处棉棒按压数分钟,防止药液溢出。造模3 d后开始给药,每日1次,分为对照组、模型组和不同浓度的通络生骨溶液组(0.5、1和2 g/kg)。给药3周后大鼠麻醉,眼眶静脉丛采血;安乐死后,打开大鼠右侧膝关节,收取软骨,液氮冻存。检测血浆中IL-1β的含量,膝关节软骨细胞中的MMP-13的mRNA表达水平以及c-Fos的蛋白表达水平。

1.4 IL-1β模型中通络生骨胶囊对SW1353细胞活性的影响

取增殖良好的SW1353细胞以1 500个/孔的密度分别接种至96孔板,置于37 ℃、5% CO2、100%相对湿度细胞培养箱中预培养24 h。空白组及对照组加入10% FBS RPMI 1640培养基,给药组分别加入浓度为1、5、10、50、100 μg/mL的通络生骨胶囊溶液(10% FBS RPMI 1640培养基配制,0.22 μm微孔滤膜过滤除菌)。每个浓度设置6个复孔,振荡混匀后,继续培养48 h。48 h后,除空白组和对照组加入10 μL RPMI 1640培养基外,模型组及给药组加入含200 ng/mL IL-1β的1640培养基10 μL,振荡混匀后,37 ℃孵箱继续培养8 h。每孔加入发光细胞活力检测试剂100 μL,放置于恒温振荡器中室温振荡15 min,在酶标仪500 nm处检测。实验重复3次,取平均值。

细胞增殖率=(观察组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%

1.5 IL-1β模型中通络生骨胶囊保护SW1353细胞的分子机制

取增殖良好的SW1353细胞以2×105个/孔的密度接种至6孔板,置于37 ℃、5% CO2、100%相对湿度细胞培养箱中预培养24 h。空白组、对照组及模型组孔加入10% FBS RPMI 1640培养基,给药组加入含10、50、100 μg/mL的通络生骨胶囊溶液,振荡混匀后继续培养48 h。48 h后,模型组及给药组加入含 IL-1β溶液使其终浓度为20 ng/mL ,振荡混匀,37 ℃孵箱培养8 h后,孔板底部细胞加Trizol裂解后提取总RNA,用反转录试剂盒反转成cDNA,利用荧光定量检测试剂盒进行RT-PCR实验,检测细胞Wnt4a、β-catenin、GSK-3β、MMP-13、ADAMTS4、 Nrf2、GCLC和NQO-1的 mRNA表达水平。用Western-Blot的方法检测β-catenin和MMP-13的蛋白表达水平。荧光定量PCR检测按照荧光定量试剂盒说明书操作,Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪检测,结果以相对表达定量(relative quantity,RQ)表示。

RQ=2-ΔΔCt

ΔΔCt=待测标本的ΔCt-对照标本ΔCt

ΔCt=目的基因Ct值-内对照Ct值

Western-Blot方法:细胞培养结束后胰酶消化收集细胞,NP40裂解液裂解,等量蛋白上样,经SDS-PAGE 电泳后,低温转印至PVDF膜,牛奶封闭1 h,再与相应的一抗、二抗杂交各1 h,用凝胶成像系统对图像进行拍照和分析。

1.6 统计学处理

结果采用SPSS17.0统计软件进行数据处理,实验数据进行Dunnett’s test检验。P≤0.05表示具有统计学意义。

2 结果

2.1 通络生骨胶囊对SD大鼠OA模型的治疗作用

通络生骨胶囊给药21 d后,大体解剖观察关节腔发现:对照组中关节腔未见明显积液,滑膜未见充血、肿胀,关节软骨表面光滑,色泽明亮;模型组中关节腔积液明显增多、滑膜增生、充血、肿胀,软骨表面粗糙,色泽灰暗,表面出现裂隙深达软骨中层,部分样本软骨缺损;通络生骨中、低剂量组:关节腔积液较模型组减少,滑膜中度增生,软骨表面粗糙,色泽灰暗,表面出现裂隙深达软骨中层,未见软骨缺损;通络生骨高剂量组:关节腔积液减少,滑膜轻度增生,软骨表面粗糙,软骨表面出现小裂隙,未见软骨缺损。

给药21 d后,不同剂量的通络生骨胶囊(0.5、1、2 g/kg)均能有效抑制血浆中碘乙酸诱导的IL-1β的分泌、降低软骨组织中MMP-13 mRNA的表达水平以及c-Fos的蛋白表达水平,呈显著的剂量依赖性,结果见图1。

2.2 IL-1β模型中通络生骨胶囊对SW1353细胞的保护作用及对Wnt/β-catenin信号通路的影响

在SW1353细胞中,与对照组相比,20 ng/mL IL-1β可一定程度上损伤细胞,细胞活率为78%。与模型组相比,10、50、100 μg/mL通络生骨胶囊组细胞活率显著性增加,结果见图2A,提示通络生骨胶囊显著性降低 IL-1β对软骨细胞的损伤作用。进一步检测IL-1β诱导的Wnt/β-catenin信号通路发现:通络生骨胶囊显著性的抑制IL-1β激活的Wnt4a、β-catenin、GSK-3β的mRNA表达水平,结果见图2。

注:与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01图1 通络生骨胶囊对碘乙酸诱导的骨关节炎的治疗作用

注:与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01图2 通络生骨胶囊对对Wnt/β-catenin信号通路的影响

2.3 IL-1β模型中通络生骨胶囊对金属蛋白酶MMP-13、ADAMTS4的影响

在SW1353细胞中,与对照组相比,20 ng/mL IL-1β极显著的诱导金属蛋白酶MMP-13、ADAMTS4的表达。与模型组相比,不同剂量(10、50、100 μg/mL)的通络生骨胶囊显著性的抑制IL-1β激活的MMP-13、ADAMTS4的mRNA和蛋白表达水平,结果见图3。

2.4 IL-1β模型中通络生骨胶囊对抗氧化信号通路Nrf2/NQO1的影响

在SW1353细胞中,与对照组相比,20 ng/mL IL-1β显著的抑制抗氧化损伤信号通路激活。与模型组相比,(10、50、100 μg/mL)不同剂量的通络生骨胶囊显著性的激活IL-1β抑制得的Nrf2、GCLC和NQO1的mRNA表达,结果见图4。

注:与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01图3 通络生骨胶囊对金属蛋白酶MMP-13、ADAMTS4的影响

注:与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01图4 IL-1β模型中通络生骨胶囊对抗氧化信号通路Nrf2/NQO1的影响

3 讨论

软骨细胞是软骨组织中唯一的细胞类型,是软骨内骨化的骨骼发育、关节软骨保护和关节运动功能维持的关键因素。越来越多的证据表明,软骨细胞受到过度自由基和炎症因子的损伤发生调亡与OA的发生发展密切相关[5-7]。炎症因子中IL-1β是诱导软骨细胞发生损伤调亡的一大重要诱因,IL-1β可以通过抑制软骨细胞增殖、改变软骨细胞的正常功能,刺激软骨细胞分泌金属蛋白酶(MMPs)使软骨基质发生异常降解最终导致骨关节炎的形成。通过抑制IL-1β生成,从而降低其诱导的下游生物学反应可以有效缓解软骨的破坏,延缓OA的发展进程,减少患者的痛苦[8]。

碘乙酸注射SD大鼠膝关节腔诱导的骨关节炎模型是研究OA治疗药物的经典模型,可以有效用于验证化合物治疗OA的疗效和作用机制。本次研究中采用碘乙酸模型验证通络生骨胶囊对骨关节炎的治疗作用。通过骨关节的大体观察发现,不同剂量组的通络生骨胶囊可以有效改善碘乙酸导致的软骨组织缺损,滑膜增生等现象。且与模型组相比,通络生骨胶囊各给药组中大鼠血液中IL-1β的含量显著性降低,关节软骨细胞中的MMP-13和c-Fos的含量也显著下降,呈现剂量效应。

近年来,在骨关节炎信号通路研究中经典的Wnt/β-catenin信号通路引起了广泛关注[9],成年小鼠关节软骨细胞中β-catenin的条件激活会导致关节软骨破坏,促进了终末软骨细胞的分化[10]。Ellie BM Landman等[11]研究发现,使用Wnt小分子抑制剂可以有效抑制IL-1β诱导的软骨降解,IL-1β诱导软骨细胞表达Wnt5a,Wnt7a,导致细胞外基质中的金属蛋白酶MMPs表达增强,使得关节软骨降解[12],由此证实Wnt/β-catenin信号通路参与IL-1β诱导的软骨降解过程。

Nrf2是抗氧化应激的关键转录因子,通过增强HO-1、GCLC、NQO-1等II相抗氧化酶的表达,拮抗OS形成,减弱OS对软骨细胞的损伤,在骨关节炎的形成过程中发挥重要的作用[13]。Qian Tang等[14]研究发现,IL-1β通过激活Nrf2/HO-1、GCLC的表达从而抑制NF-κB信号的活化,降低IL-1β诱导的软骨细胞调亡。

本次研究中采用了IL-1β体外损伤模型进一步研究通络生骨胶囊治疗OA的可能分子机制。发现,通络生骨胶囊可以有效缓解IL-1β对软骨细胞的损伤作用,提高软骨细胞的活率。进一步检测Wnt/β-catenin信号通路及其下游金属蛋白酶的表达水平,发现通络生骨胶囊显著性抑制IL-1β诱导活化的Wn4a、β-catenin以及GSK-3βmRNA表达水平,降低MMP-13、ADAMTS4的mRNA和蛋白表达水平,从而有效缓解IL-1β导致的软骨降解,发挥治疗OA的作用。通过对IL-1β介导的下游Nrf2/HO-1信号通路的研究观察到通络生骨胶囊可以有效增强Nrf2、GCLC、NQO-1的mRNA表达水平,降低IL-1β诱导的细胞损伤作用。

可见,通络生骨胶囊通过减少OA状态下IL-1β等炎症因子的分泌,抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化,降低下游基质金属蛋白酶MMP-13等蛋白的表达水平,从而减弱对软骨的降解作用;同时还通过诱导Nrf2/HO-1信号通路的活化,激活下游GCLC、NQO-1等II相抗氧化酶的表达,拮抗炎症因子以及OS等对软骨的损伤作用,发挥治疗OA的作用。

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