线粒体稳态与血管性痴呆的关系及中医药干预作用

秦秀德

(广州中医药大学第四临床医学院/深圳市中医院，广东 深圳 300150)

血管性痴呆(Vascular dementia,VD)是指由一系列脑血管因素引起脑损伤所致的痴呆综合征[1]，是继阿尔茨海默病后的第2大痴呆性疾病[2]，是迄今为止唯一可以防治的痴呆[3]。每7 s就有1例新发的痴呆患者。发达国家中65岁以上人群中痴呆患病率约为5%～10%，而VD的患病率约每5年左右就会加倍[4]。就我国而言，目前约有740万名老年性痴呆患者，据估算，如不采取积极措施进行有效的干预，到2030年，这一数字将会增长到1 800万左右[5]。慢性脑低灌注是血管性痴呆的一个重要原因，然而，血管性痴呆的病理机制迄今为止仍未完全阐明，目前FDA仍无批准用于治疗血管性痴呆的药物[6]。线粒体为机体产生自由基的源泉，线粒体氧化应激与脑缺血后神经细胞凋亡坏死密切相关，神经细胞缺血缺氧时激活活性氧(ROS)及一氧化氮(NO)，诱导线粒体凋亡途径，在VD发生发展过程中具有中间桥梁作用[7]。氧化应激诱导的脑线粒体功能障碍可明显破坏脑部神经细胞的Ca2+动态平衡，损伤神经功能并最终导致认知障碍[8]。深入研究VD发病的关机机制，对于新药研制及指导临床诊疗均具有非常重要的意义。中医药长期用于VD的治疗，在VD的治疗方面有众多临床疗效显著的方药。因此，本文拟就线粒体稳态与VD的关系及中医药基于影响线粒体功能而治疗VD的机制研究进行论述。

1 血管性痴呆实验动物线粒体稳态的相关研究

1.1 VD实验动物海马线粒体肿胀

线粒体水肿或肿胀是基于形态学方面表明线粒体的功能障碍。姚国恩等采用改良Pulsinelli's四血管阻断法建立Wistar大鼠(雌雄不拘)血管性痴呆大鼠模型,发现模型大鼠海马CA1区神经元的线粒体肿胀，线粒体嵴紊乱[9]。赵小贞等采用2-VO法制备雌性SD大鼠VD模型，结果显示，VD大鼠海马CA1区神经组织线粒体肿胀、嵴断裂、模糊或消失,微管断裂、排列紊乱[10]。刘锡棐等通过投射电镜观察Pulsinelli's四血管阻断改良法所致VD的SD大鼠(6月龄大鼠,雌雄各半)海马组织切片，发现部分神经细胞胞浆内线粒体明显水肿[11]。刘锡棐等采用电灼烧针封闭阻断SD大鼠双侧椎动脉,雌大鼠摘除左侧卵巢,雄大鼠摘除左侧睾丸,制成血管性痴呆模型大鼠。结果表明，VD大鼠的下丘脑神经细胞胞质突起水肿，线粒体固缩，而海马CA1区神经细胞线粒体水肿、嵴断裂[12]。唐红梅等采用2-VO法制作雄性SD大鼠VD模型，电镜观察发现VD模型大鼠额叶皮层神经元线粒体线粒体明显水肿破裂，线粒体嵴结构不清晰，线粒体部分固缩[13]。

1.2 VD大鼠海马神经元和皮层神经元线粒体膜电位水平下降

线粒体是细胞能量产生的关键细胞器，其正常产能有赖于膜电位的稳定。膜电位异常会影响线粒体进行氧化磷酸化，诱发能量生成障碍[14]。细胞凋亡常伴有线粒体膜电位的下降，膜电位的下降可能是细胞凋亡的先兆[15]。赵冉冉等采用2-VO法复制雄性Wistar大鼠VD模型，对VD大鼠海马组织切片超微结构观测显示，海马组织线粒体肿胀，嵴消失，排列紊乱。进一步以JC-1作为线粒体探针，用流式细胞术检测。结果显示，VD组大鼠海马组织中线粒体膜电位与假手术组相比明显下降(P<0.01)。Pearson相关分析显示，VD组海马线粒体膜电位与Morris水迷宫5天逃避潜伏期平均值呈负相关(r=-0.693，P=0.001)，与目标象限停留时间呈负相关(r=-0.598，P=0.001)[16]。

1.3 VD实验动物海马线粒体数量减少

线粒体轻微受损可由线粒体动力学进行对抗；而损害严重时细胞将启动线粒体自噬机制整体清除损伤，维持线粒体稳态[17]。线粒体数量减少是各种损伤影响线粒体稳态进而导致线粒体自噬、凋亡最直接的表现形式。赵宪林等采用2-VO方法对Wistar雄性大鼠制作血管性痴呆模型，发现海马区神经元线粒体数量减少[18]。吕佩源等采用2-VO法制作雄性昆明小鼠VD模型，对海马组织进行超薄切片，电子投射显微镜下观察发现，在神经元胞核变化尚轻微时,核周体胞质中的多种细胞器,如线粒体、粗面内质网、高尔基体和多聚核糖体就已有不同程度减少,并出现大小不等的空泡。病变严重时,可见残存的线粒体空泡化或均质化,粗面内质网离散,多聚核糖体消散[19]。

1.4 VD实验动物海马线粒体COX活性下降

细胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase,COX)被公认是线粒体的标志酶，在线粒体氧化磷酸化产生ATP中，COX是非常关键得一种酶[20]。COX是神经元内源性代谢兴衰的重要标志，神经元的功能活动与其活性密切相关。赵晴等的研究表明，采用双侧颈总动脉永久结扎方法，制备雄性Wistar大鼠慢性前脑缺血大鼠模型，在造模术后VD大鼠海马组织COX活性明显低于正常大鼠。VD大鼠海马组织线粒体COXⅡ基因有5处突变，与正常对照组比，新出现2处突变；VD大鼠海马组织线粒体COXⅢ基因新出现2个突变位点[21-22]。且经自由基清除剂依达拉奉治疗后，VD大鼠海马线粒体COX活性及COXⅡ表达明显增加[22]。刘雨霞等采用2-VO法制作雄性SD大鼠VD模型，其研究结果表明，VD大鼠CytC表达水平明显升高[23]。白雪等的研究表明，与模型组比较，祛风通窍方高、中剂量组COX活性明显升高，COXⅡmRNA表达明显增加。据此认为祛风通窍方对VD大鼠线粒体功能的保护作用可能与其改善VD大鼠线粒体COX活性，增加COXⅡmRNA的表达有关[24]。

1.5 VD实验动物Na+-K+-ATP酶活性下降

杨牧祥等采用2-VO双侧颈总动脉结扎法建立雄性昆明小鼠VD模型，发现模型小鼠海马组织线粒体局部水肿的嵴的数量减少，排列比较紊乱，大部分线粒体嵴与膜融合；将脑组织匀浆后用生物化学法测ATP酶活力，结果显示，脑皮质细胞Na+-K+-ATP酶活力与假手术组相比明显降低(P<0.05)[25]。

1.6 VD实验动物海马区神经元线粒体自噬

线粒体对神经元的生长发育具有重要作用，线粒体功能障碍时，细胞一磷酸腺苷/三磷酸腺苷(AMP/ATP)比例上调，将激活AMP依赖的蛋白激酶-雷帕霉素靶蛋白(AMPK-mTOR)通路，诱导自噬小体的生成，导致线粒体清除途径紊乱[26]。刘斌等采用改良Pulsinelli's四血管阻断(4-VO)法制作雄性SD大鼠VD模型，其研究结果表明，造模后1周时VD大鼠海马CA1区的神经细胞胞质电子密度增加，核膜凹陷，胞核浓缩明显，可见有少量正常的线粒体及空泡变的线粒体，粗面内质网扩张，核周见微空泡形成，多聚核糖体解聚，高度肿胀，细胞器稀少，出现自噬体，呈圆形，大多位于细胞核旁，初级溶酶体数量增多；在造模4周时自噬体、溶酶体数量显著增多，有时可见自噬体包裹的线粒体残体，并可见到自噬现象的发生[27]。

1.7 VD实验动物线粒体氧化应激水平增高

1.8 VD实验动物线粒体凋亡相关信号改变

通过抑制线粒体氧化应激及相关凋亡信号通路可以实现对神经元损伤的保护作用[32]。陈天智等通过2-VO法制作雄性SD大鼠VD模型，其研究结果表明，与假手术组相比，VD组海马CA1区Bcl-2蛋白表达明显降低，而Bax蛋白表达显著升高；激光扫描共聚焦显微镜结果显示VD组海马CA1区神经元中CytC与线粒体标志性蛋白TOM20的共表达较假手术组明显减少；p53上调凋亡调控因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis,PUMA)基因蛋白于VD造模术后14、21天的表达较假手术组明显升高。表明血管性痴呆早期神经元线粒体产生的损伤可能与PUMA介导的凋亡通路相关[33]。

表1 血管性痴呆大鼠线粒体改变情况

2 相关的中医药对线粒体稳态的干预作用

2.1 减轻线粒体水肿

刘锡棐等的研究表明，补肾活血为主要功效的康欣胶囊可明显减轻VD大鼠海马神经细胞胞浆内线粒体水肿[11]。刘锡棐等的另外一项研究结果表明，经康欣胶囊干预后，VD大鼠的下丘脑神经细胞胞质微管螺旋状排列，线粒体正常；海马CA1区神经细胞线粒体轻度水肿[12]。参芎化瘀胶囊组海马CA1区多数神经元细胞核染色质分布比较均匀，与模型组相比，胞质内线粒体及其他细胞器基本正常，偶可观察到少量的染色质凝集，线粒体发生轻度肿胀[34]。唐红梅等的研究表明，与模型组比较，祛风通窍方高、中剂量组额叶皮层神经元细胞轻微变形，基质内颗粒减少，线粒体嵴清晰，可见轻微水肿，正常线粒体多见;低剂量组神经元细胞变形得到一定的改善，但仍有大部分线粒体水肿明显，线粒体固缩变性相对较少[13]。

2.2 增加线粒体数量

孔祥怡等采用2-VO法制作Wistar雄性大鼠VD模型(线粒体数量减少)，采用人参皂苷进行治疗，结果表明，VD大鼠经干预1个月后，神经细胞核染色浅，可见少量异染色质位于核膜或散在分布于细胞核中，线粒体数量较多、偶见空泡状；经治疗3个月后，神经细胞核染色浅，偶可见异染色质，细胞的核仁清晰，细胞内线粒体较多，偶可见空泡化[35]。睿祺片(药物组成:首乌、蜂胶、荷叶、珍珠母粉等)可增强原代培养胎鼠皮层神经细胞线粒体活性,提高线粒体的数量，并认为其在防治血管性痴呆等神经退行性疾病方面具有一定的应用前景[36]。

2.3 提高ATP酶活力

ATP是脑组织的主要能量来源。杨牧祥等研究表明，低剂量醒脑启智组VD小鼠的线粒体局部水肿的嵴的数量明显减少，排列较为紊乱，部分的线粒体嵴与膜融合；粗面内质网可见有脱颗粒现象，细胞间的紧密连接模糊不清，吞饮小泡减少，部分双层核膜融合消失，部分核间隙扩大。高剂量醒脑启智组的少数线粒体嵴出现断裂融合，粗面内网形态正常，无脱颗粒现象。高剂量醒脑启智组脑皮质细胞ATP酶活力比其他组明显升高[25]。

2.4 提高线粒体呼吸链关键酶的活力

线粒体呼吸链酶容易受到脑缺血的损伤，在2-VO法制作的VD模型大鼠中，线粒体呼吸链复合酶活性较正常组明显降低，线粒体膜电位发生去极化，同时ROS含量升高[37]。脑缺血缺氧可导致CytC从神经元的线粒体内释放至细胞浆中[38]，由此进而引发后续的神经元细胞死亡或凋亡[39]。LiH等通过2-VO法建立VD模型，经针灸治疗发现海马线粒体呼吸复合酶(复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ)活性和Cyt C氧化酶Ⅳ的表达显著增加。此外，针刺治疗后线粒体生物能参数如线粒体呼吸控制率和膜电位PDHA1的表达明显改善[37]。Zhang X等应用三焦针法治疗多梗死性痴呆(MID)大鼠，其研究结果表明，针刺治疗可改善MID大鼠的呼吸控制水平、磷氧比值及线粒体呼吸链关键酶的活性[40]。

2.5 通过线粒体凋亡通路启动抗凋亡机制

近年也出现了基于对线粒体稳态通路调节作用抗凋亡的研究。孙邈等采用2-VO法制备雄性SD老年大鼠VD模型，并研究复智胶囊对线粒体凋亡通路的影响，其研究表明，较之模型组，复智胶囊高、低剂量组和安理申组大鼠学习记忆能力均得到提升，逃避潜伏期和游泳路程均有缩短，跨越原平台次数明显增多，Cleaved Caspase-3表达下降，促凋亡基因Bax降低，并且凋亡抑制基因Bcl-2升高，Bcl-2/Bax的比值改变(P<0.05)。由此认为复智胶囊对VD大鼠学习记忆能力的改善作用可能是基于通过线粒体凋亡通路启动抗凋亡机制[41]。

2.6 提高线粒体复合物的活性

谢守嫔等采用2-VO法制备Wistar雌性VD模型，并用中药复方归芪聪志汤进行治疗。结果表明，与模型组比较，归芪聪志汤中剂量组大鼠海马组织线粒体复合物Ⅰ～Ⅴ的活性及ATP含量明显升高，除归芪聪志汤中剂量组的线粒体复合物Ⅰ与模型组比较差异无统计意义外，其他均有统计意义(P<0.05);归芪聪志汤中剂量组大鼠大脑皮层其他部位线粒体复合物Ⅰ～Ⅴ的活性均升高，其中线粒体复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ差异有统计意义(P<0.05)，ATP含量均降低，但差异无统计意义(P>0.05)[42]。

3 小结与展望

VD多因心脑血管病变、出血、缺血或缺氧性脑损伤等系列因素导致患者脑组织损害，引发智力障碍与认知障碍综合征，影响患者的生活质量[2,43]，是脑血管病导致认知功能障碍的重要临床类型[44]。VD发病率与患者年龄呈正相关，伴随人口老龄化的加剧，VD发病率呈现较快增长的趋势，给家庭及社会造成较大的负担[45]。我国血管性痴呆病人数量较大，防治任务艰巨[5]。VD的具体发病机制尚未完全阐明，目前认为缺血性或出血性脑卒中以及各种原因引起的脑缺血缺氧等原因均可导致VD的发生。由脑缺血缺氧产生的过量自由基可影响生物体膜磷脂中不饱和脂肪酸含量，从而导致过氧化及MDA产生，进而引起脑组织脂质过氧化损伤，最终导致以认知功能障碍为主要表现的痴呆的发生[46]。目前无论是手术或是药物方面都没有完全治愈AD的有效方法，而VD是迄今为止唯一可以防治的痴呆，其早期治疗具有可逆性[47]。线粒体功能障碍正在成为神经系统疾病病因学中最新兴的病理过程之一,神经退行性疾病的主要病理特征是线粒体调控的细胞凋亡,保护线粒体功能已被认为是减轻神经退行性疾病发病机制最有效的治疗方法[48]。现代药理研究表明，中医药治疗VD具有一定疗效[49],具有多靶点、多途径治疗特征，在VD防治方面具有独特优势，中西医联合治疗VD较单纯西医治疗呈现出更为明显的优势[50]。本文通过系统查阅国内外文献，发现目前中医药基于线粒体保护方面防治血管性痴呆的机制包括减轻神经元线粒体水肿、增加线粒体数量、提高ATP酶活力、提高线粒体呼吸链关键酶的活力、通过线粒体凋亡通路启动抗凋亡机制、提高线粒体复合物的活性等方面。虽然目前已经有一定数量的研究探索中医药基于线粒体保护防治VD的机制，但仍存在一定的问题：1)较多的集中在传统中药复方方面的研究，而基于现代中药新药创制理论的中药组分研究及中药活性单体组分的研究相对较少；2)目前的研究较多的停留在对线粒体形态、线粒体数量、膜电位等方面的研究，而对于线粒体稳态的信号通路的研究相对较少。建议以后可适当基于上述层面或方向进行研究，以便筛选出针对线粒体稳态的疗效卓著的中药组分或单体，助推治疗血管性痴呆的新药创制。