KIFC3基因在结直肠癌中的表达及预后分析

林佳钿，谢喜娜

(1.北京大学深圳医院微创介入科，广东 深圳 518036；2.深圳大学第一附属医院转化医学研究院，广东 深圳 518035；3.汕头大学医学院细胞生物学与遗传学教研室，广东 汕头 515041)

结直肠癌作为常见的消化系统肿瘤，其转移治疗效果不佳，机制不明，是临床亟待解决的重要问题。驱动蛋白超家族分子(kinesin superfamily proteins，KIFs)异常表达可以导致有丝分裂过程中DNA的不平等分布，从而产生异倍体细胞，进而与肿瘤的恶性进展密切相关[1-2]。目前，多种KIFs家族成员已被证实参与结直肠癌、胃癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、恶性胶质瘤等多种肿瘤的发生发展过程[3-8]。驱动蛋白家族分子C3(kinesin family member C3，KIFC3)属于KIFs第14亚家族，参与乳腺癌紫杉醇的化疗抵抗[9]，并且与肝细胞癌的预后相关[10]。然而，目前KIFC3与结直肠癌发生、发展相关的报道较少见。本研究主要通过肿瘤基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)和Oncomine数据库及临床结直肠癌样本，比较KIFC3在结直肠癌中的表达以及对生存预后的影响，为进一步阐明KIFC3在肿瘤发生、发展中的作用机制提供参考，也为结直肠癌的早期辅助诊断和预后判断提供新线索。

1 资料与方法

1.1数据资料收集 通过UCSC Cancer Browser(https://genome-cancer.ucsc.edu)下载TCGA数据库中结直肠癌组织的RNA表达数据，并提取结直肠癌病例的临床参数和生存资料(TCGA_COADREAD_exp_HiSeqV2-2015-02-24)。分析TCGA数据库中50例正常结直肠组织和380例结直肠癌组织KIFC3的表达水平。通过Oncomine数据库(https://www.oncomine.org)中Gaedcke结直肠癌[11]和Notterman直肠癌[12]数据集进一步比较KIFC3在结直肠癌组织和结直肠正常组织中的表达水平。

1.2临床组织标本收集 收集2017年1—6月从汕头大学医学院附属第一医院收治的19例经结直肠癌手术切除治疗的结直肠癌患者，每例标本包括癌组织及癌旁正常组织(距离肿瘤边缘≥3 cm)。新鲜组织标本离体后30 min内放入液氮速冻，后转入-80 ℃ 冰箱保存。纳入标准：①所有病例术前未进行过放化疗及介入治疗；②临床资料完整；③均经病理学诊断确诊为结直肠癌。排除标准：①合并其他肿瘤；②术后1个月内出现严重并发症、复发或死亡。其中男14例、女5例；患者年龄30～86岁，平均(55±18)岁，肿瘤浸润程度：T1～2期4例，T3～4期15例；发生淋巴结转移8例，无淋巴结转移11例；远处转移5例，无远处转移14例；肿瘤分化程度：低分化13例，高分化6例。本研究获得汕头大学医学院附属第一医院伦理委员会批准(批准号：SUMC-2015-42)，患者均签署知情同意书。

1.3材料 Trizol试剂购自美国英杰公司；反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)试剂盒购自瑞士罗氏公司；其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯；KIFC3及β肌动蛋白(β-actin)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司根据设计合成。

1.4qRT-PCR检测结直肠癌组织及其癌旁正常组织中KIFC3 mRNA的表达 称取5 mg组织样品，用研磨研碎，加入1 mL Trizol，转移至1.5 mL离心管中；每管加入200 μL氯仿萃取RNA，静置5 min后用4 ℃离心机12 000×g离心15 min；取出上清液至新的离心管，加入600 μL异丙醇沉淀，10 min后用4 ℃离心机12 000×g离心10 min，弃上清液，用1 mL 70%乙醇清洗RNA沉淀；干燥RNA后用 60 μL 无RNA酶的水溶解RNA，用分光光度计检测总RNA的浓度和纯度。参照逆转录试剂盒实验操作说明取1 μg总RNA逆转录为互补DNA。使用Primerbank数据库(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)[13]中KIFC3及β-actin的引物序列(KIFC3 上游引物:5′-GCAGATTGCCATGTACGAGTC-3′，下游引物:5′-CGGACGCCTGCTAGATTCTC-3′；β-actin上游引物:5′-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3′，下游引物:5′-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA -3′)。根据qRT-PCR试剂盒操作说明进行扩增。将2 μL互补DNA、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、10 μL SYBR(Synergy Brands Synergy Brands)混合液和7 μL双蒸水建立20 μL的反应体系，按“95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40个循环”的反应条件进行扩增。反应结束后获取基因表达的cycle threshold值，以β-actin为内参，用2-ΔCt法[14]计算KIFC3的相对表达量。

2.3KIFC3高表达组与低表达组患者的预后比较 将TCGA数据库中的数据按照KIFC3表达水平的平均数(8.217 698)进行二等分，其中KIFC3 mRNA表达>8.217 698为KIFC3高表达组，≤8.217 698为低表达组。Kaplan-Meier plotter生存分析显示,KIFC3表达水平的高低可以影响结直肠癌的总体生存期(P=0.018)，但不影响无病生存期(P=0.093)，KIFC3高表达组的患者总生存期短于KIFC3低表达组，见图1。单因素Cox回归分析显示,年龄、病理分期、远处转移、淋巴结转移和KIFC3水平可以影响患者的总体生存时间(均P<0.05)，见表3；将上述影响因子进行多因素Cox回归分析，结果显示除年龄和远处转移外，KIFC3的表达水平仍可以影响总体生存期(P<0.05)，即KIFC3 mRNA高表达患者的死亡风险约为低表达的1.8倍。见表4。

试卷以能力立意设计试题，考查了思维能力、运算求解能力、空间想象能力等能力．在此基础上，特别突出了对数学思维的全面、深刻考查，大量题目考查了观察、联想、类比、猜想等数学思维方法与能力，对函数与方程、数形结合、分类与整合、化归与转化等数学思想进行了较全面的考查．

2 结 果

2.2结直肠癌患者各项临床病理特征KIFC3表达水平的比较 运用TCGA数据库中结直肠癌患者的临床数据进行分析，结果显示，不同性别、年龄、是否发生远处转移的KIFC3 mRNA比较差异无统计学意义(P>0.05)，发生淋巴结转移的KIFC3 mRNA水平高于无转移者，肿瘤浸润T3～4期的KIFC3 mRNA水平高于肿瘤浸润T1～2期的患者，病理分期Ⅲ～Ⅳ期的KIFC3 mRNA水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.01)。见表2。

（二）回归课本，精选习题。教材是知识的载体，不熟悉教材就没办法形成知识网络体系。基础知识就不能准确、完整把握。所以说复习的最高境界就是将习题与课本有效的统一起来，可以多做点典型例题，在做题的过程中，把课本当成工具书查漏补缺，尽快发现自己哪些知识点的掌握还不到位，有针对性地看书，同时用心体会解题的思路，以提高能力；建议不时的翻翻书，在有限的时间内，如果集中精力把课本上最基本的内容弄清弄活，不致使知识遗忘。在每节课上都要精选习题，在每一次的考试命题中，一定要研究近年来的高考题。不仅研究采点和命题的形式，而且在语言的描述上也要细细揣摩研究命题意图。

2.1结直肠癌组织和正常组织中KIFC3表达水平比较 TCGA数据库中，结直肠癌组织KIFC3的表达水平高于正常组织(P<0.01)。Oncomine数据库Gaedcke和Notterman数据集中，结直肠癌组织KIFC3的表达水平显著高于正常组织(P<0.01)。进一步通过qRT-PCR技术检测19例结直肠癌组织及癌旁正常组织中KIFC3的水平，与癌旁正常组织比较，结直肠癌组织中KIFC3的表达显著升高(P<0.05)。见表1。

结直肠癌是常见的消化系统肿瘤，在恶性肿瘤中排第三位，在因癌症导致死亡的病因中居第四位。根据《CA Cancer J Clin》癌症统计数据显示，2015年中国结直肠癌新发病例约376 300例，死亡率达50%[15]。美国2017年癌症报告预计，2017年大约新增135 430例结直肠癌患者，死亡率达37.1%[15]。目前根治性手术切除辅以合理的放化疗是结直肠癌的主要治疗手段，但治疗效果并不理想，30%～50%的患者术后出现复发[16]，且生存率不高，发生转移的患者5年生存率仅有10%～15%[17]。可见，结直肠癌的发病形势十分严峻，但其发病与转移的分子机制尚不明确，这也一直是制约结直肠癌诊疗的主要瓶颈。目前，寻找新的高敏感性、准确性和特异性的预后标志物以提高诊疗效果是结直肠癌早期诊治的关键。

组别例数KIFC3水平t值P值TCGA数据库正常组织结直肠癌组织503807.13±0.768.22±1.039.038a<0.001Oncomine数据库Gaedcke数据集正常组织结直肠癌组织6565-0.53±0.30 0.54±0.5114.524a<0.001Notterman数据集正常组织结直肠癌组织18181.96±0.522.49±0.513.067a0.004临床收集样本正常组织结直肠癌组织19192.07±4.933.39±6.262.151b0.045

KIFC3：驱动蛋白家族分子C3；TCGA：肿瘤基因组图谱；a为独立样本t检验，b为配对样本t检验

项目例数KIFC3水平t值P值性别男女2051668.21±1.028.22±1.040.0960.924年龄≤65岁>65岁1811908.18±1.048.25±1.020.6680.504远处转移否是251498.21±1.038.39±0.881.1800.239淋巴结转移否是2031648.05±1.058.42±0.973.4730.001肿瘤浸润T1～2期T3～4期703007.87±1.038.30±1.013.1590.002病理分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期1911678.06±1.078.38±0.952.9290.004

KIFC3：驱动蛋白家族分子C3

KIFC3：驱动蛋白家族分子C3

表3 KIFC3水平和各种临床因子与总体生存率的单因素Cox回归分析

KIFC3：驱动蛋白家族分子C3

表4 KIFC3水平和各种临床因子与总体生存率的多因素Cox回归分析

KIFC3：驱动蛋白家族分子C3

3 讨 论

例3中的“highly likely”不仅表达极大的可能性，还透露出一种积极的主观上的高度期待，而例4中的“likely”却表达一种负面的推测，暗示“一带一路”倡议的一种消极的可能性。这种差异也表现在“基于证据或表象的假定”（evidence/appearance-based postulation）的使用上，例如：

KIFs在真核细胞中广泛表达，并在细胞分裂和囊泡与细胞器的胞内转运过程中发挥重要作用[18]。在有丝分裂过程中，KIFs被瞬时合成并与微管结合，直接调节纺锤体和姐妹染色单体的正常分离[19-20]；一旦KIFs出现异常表达，将导致有丝分裂过程中DNA的不平等分布，产生异倍体细胞，进而介导肿瘤的恶性进展[1-2]。研究表明，多种KIFs家族成员参与结直肠癌、胃癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌等多种肿瘤的发生发展过程；已有几个小分子KIFs抑制剂进入癌症治疗的临床研究[3-6]。KIFs由45个功能各异的成员构成，根据结构不同又可分成14个亚家族[21]。其中，KIFC3属于KIFs第14亚家族，在结直肠癌中的表达及其临床意义尚不清楚。鉴于先前已报道的KIFC3与肝细胞癌的预后相关[10]，对KIFC3在结直肠癌中相关机制及临床意义的深入研究，有助于提高结直肠癌的诊治及预测水平。

本研究首先通过TCGA和Oncomine数据库分析显示，KIFC3在结直肠癌组织中的表达明显高于正常结直肠组织，并通过对临床结直肠癌标本进行检测验证了数据库的分析结果。进一步利用TCGA数据库中结直肠癌患者的临床病理资料进行分析，结果显示KIFC3的表达水平对淋巴结转移、肿瘤浸润和病理分期有影响。本研究生存分析表明，KIFC3 的表达影响结直肠癌的总体生存期，KIFC3表达水平越高，结直肠癌患者总生存时间越短。多因素Cox回归分析校正其他影响因子的作用，发现结直肠癌患者中KIFC3 mRNA高表达的死亡风险约为低表达的1.8倍，提示KIFC3可以作为结直肠癌临床预后的一个独立预测因子。本研究结果与KIFC3在肝细胞癌中的研究报道[10]相似，提示KIFC3对肿瘤发生发展的临床作用及其预后判断价值可能具有一定的临床意义，也将KIFC3作为新的治疗靶点运用到肿瘤的防治过程提供了依据。

我明白他的意思。之后的日子里，我试图去忘掉那天看到的一切，但老陈却对我说起了那起车祸。那个女人，真的死了。当时，她看我那一眼是不是她生命中最后一眼。

综上所述，在结直肠癌组织中，KIFC3表达水平升高，且可以影响患者的预后，有望作为结直肠癌临床预后的一个潜在独立预测因子。对KIFC3的深入研究可进一步揭示其在结直肠癌中的功能及作用机制，为结直肠癌的早期辅助诊断和基因靶向治疗提供新思路。