乳腺癌干细胞相关miRNA的高通量筛选及miR-25介导自噬对乳腺癌干细胞的调控作用

王能，王志宇，张奉学，廖勉勉，何豫，张晓彤

(1.广州中医药大学a.基础医学院中西医结合基础研究中心，b.第二临床医学院，广州 510006；2.中山大学肿瘤防治中心，广州 510060)

近年来，肿瘤干细胞相继在乳腺癌、淋巴瘤、肝癌、食管癌等肿瘤中被发现。这类细胞具有自我更新、多向分化的特点和强大的体内致瘤性，被认为是肿瘤发生、发展和转移的根本原因[1-3]。Al-Hajj等[4]通过表面分子标志CD44+/CD24-/Low/乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)1+分离并鉴定了人类乳腺癌干细胞，发现这群仅占癌细胞总数0.2%～0.8%的细胞具有极高的体内致瘤能力，约是普通肿瘤细胞的100倍。研究显示，乳腺癌干细胞与微RNA(microRNA，miRNA)调控密切相关[5]。miRNA是一类内源性、保守性的非编码小分子RNA，其主要通过与靶标信使RNA特异性的碱基配对，引起靶标信使RNA降解或抑制其翻译过程而发挥调控作用，广泛参与各种生理及病理生物学过程[6]。自噬是将细胞自身受损的细胞器和大分子物质包被入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹内容物的过程[7]。目前研究表明，自噬活性可能对肿瘤干细胞功能有重要影响[8]。本研究以乳腺癌干细胞为研究对象，通过miRNA芯片筛选并鉴定与药物敏感性相关的miRNA，通过实时自噬活性监测、流式检测及干细胞成球实验明确miR-25介导自噬影响乳腺干细胞自我更新能力的作用。

1 材料与方法

1.1细胞培养 MDA-MB-231乳腺癌细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，培养体系使用美国Gibco公司的高糖改良杜氏伊格尔培养基(批号：C11995500BT)，并添加10%南美胎牛血清(美国Gibco公司生产，批号：10270-106)和1%双抗(美国Gibco公司生产，批号：PB180160)；前期已将MDA-MB-231乳腺癌细胞利用分子标记CD44+/CD24-/ESA+流式分选获得其相应干细胞，即MDA-MB-231乳腺癌干细胞[9]。本研究使用干细胞培养体系进行扩增培养，即高糖改良杜氏伊格尔培养基/F12培养基(美国Gibco公司生产，批号：C1330500BT)、5 μg/mL胰岛素(武汉普诺赛生命科技有限公司生产，批号：PB180434)、20 μg/L人表皮生长因子(上海近岸科技有限公司生产，批号：P01133)、1%双抗(美国Gibco公司生产，批号：PB180160)、0.4%牛血清蛋白(美国Sigma公司生产，批号：B2064)和B27(美国Gibco公司生产，批号：17504044)。非乳腺癌干细胞和MDA-MB-231乳腺癌干细胞(简称乳腺癌干细胞)均放置在5%CO2、37 ℃培养箱中，根据细胞生长情况1～3 d换液。

1.2干细胞成球实验 将103个数/孔的细胞用干细胞培养液重悬后，接种于低吸附培养板中培养至干细胞微球形成后，在倒置生物显微镜(福建麦克奥迪实业集团有限公司生产，型号：AE2000)下观察拍照。之后可将第一代干细胞微球通过机械吹打重新制备成单细胞悬液，重新形成第二代微球处理并进行拍照观察。

1.3miRNA芯片及生物信息学分析 常规培养乳腺癌干细胞和非乳腺癌干细胞后，采用miRNA微阵列芯片检测miRNA的表达并对其表达谱进行差异性分析。具体方法为采用鲁棒多芯片平均算法进行芯片标准化后，随即对乳腺癌干细胞与非乳腺癌干细胞进行差异miRNA分析。由于乳腺癌干细胞组和非乳腺癌干细胞组分别为2个样本，因此采用差异倍数的方法进行筛选，乳腺癌干细胞的均值/非乳腺癌干细胞的均值>3或≤0.333 3为差异miRNA。将获得的差异miRNA按照5个数据库(miRWalk、miRanda、miRDB、RNA22和Targetscan)预测其靶基因，并选择5个数据库同时支持的结果，随后对获得的靶基因进行基因本体论(gene ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析。GO富集分析利用Fisher精确检验和多重比较检验计算每个功能的显著性水平(P)和误判率，对靶基因进行基因功能注释。显著性筛选的标准为P≤0.05，误判率≤0.05。通路富集分析基于KEGG数据库，对靶基因利用Fisher精确检验和χ2检验，将目标基因参与通路进行显著性分析，按照P≤0.05进行筛选。

1.4miR-25检测 ①miR-25的表达水平检测：采用北京天根生化科技有限公司的miRcute miRNA提取分离试剂盒(批号：DP501)对miRNA进行富集和提取。互补DNA合成和定量聚合酶链反应检测采用广州易锦生物技术有限公司的miRNA定量试剂盒(批号：QP015)，其中miR-25引物(批号：HmiRQP0352)和内参U6(批号：HmiRQP9001)均由该公司合成并提供。②miR-25的细胞转染：分别将上海汉恒生物科技有限公司合成的miR-25类似物Mimics(批号：HH20190703GYQ-MIR01)及其阴性对照(Nc)(批号：HH20190703GYQ-MIR03)、miR-25抑制剂Inhibitor(批号：HH20190703GYQ-MIR02)及其阴性对照(Anti-Nc)(批号：HH20190703GYQ-MIR04)用无血清培养液稀释，与稀释后的RNAFit转染试剂(上海汉恒生物科技有限公司生产，批号：HB-RF-1000)室温混合20 min后，加入接种对数生长期乳腺癌干细胞的6孔板中，37 ℃培养48 h后检测。

1.5ALDH流式检测 使用ALDEFLUOR试剂盒(加拿大Stemcell公司生产，批号：QCSH024)检测ALDH干细胞比例变化。实验分为miR-25类似物Mimics及其阴性对照(Nc)两组，利用RNAFit转染试剂转染目的细胞后，将细胞重悬调整浓度为107个数/mL，与ALDH底物在37 ℃条件下共同孵育，每个检测管均需设置对照管，即加入ALDH特异性抑制剂二乙氨基苯甲醛。反应45 min后利用流式细胞仪(美国BD Biosciences公司生产，型号：FACSAria SORP)上机检测。每组实际ALDH干细胞比例(%)=检测管ALDH干细胞比例(%)-对照管ALDH干细胞比例(%)。

1.6实时自噬活性监测 使用上海汉恒生物科技有限公司的微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)自噬双标腺病毒红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)-LC3(批号：HB-AP210 0001)感染目的细胞，48 h后观察细胞自噬变化[7]。具体步骤为将105个数/孔的细胞用500 μL培养液重悬后接种至24孔板中，37 ℃过夜培养，使第2天细胞的生长汇合率为50%～70%。第2天进行病毒感染，根据感染复数加入相应病毒量，24～48 h后利用共聚焦显微镜(德国卡尔蔡司公司生产，型号：Axio-Imager_LSM-800)对GFP和RFP的表达进行观察。

1.7自噬相关蛋白表达的检测 通过施加紫杉醇激活自噬，再向乳腺癌干细胞体系中施加miR-25 Mimics增加miR-25的表达或施加miR-25 Inhibitor降低其表达，使用蛋白质印迹法检测细胞中自噬相关蛋白的表达，分为空白对照组、紫杉醇组、Nc+紫杉醇组、Mimics+紫杉醇组、Anti-Nc+紫杉醇组和Inhibitor+紫杉醇组。主要步骤包括细胞总蛋白抽提、二喹啉甲酸法测定总蛋白含量、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳制备和上样、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育及电化学发光显影。其中，使用的一抗包括LC3(美国Proteintech公司生产)、p62(美国Proteintech公司生产)、UNC-51样激酶1(UNC-51-like kinase 1，ULK1)(美国Proteintech公司生产)和β-actin(美国CST公司生产)，以及二抗兔或抗小鼠抗体(美国CST公司生产)。所得结果采用Image J软件(https://imagej.nih.gov/ij/)进行数据处理。

2 结 果

2.1乳腺癌干细胞的培养和观察 与非乳腺癌干细胞相比，乳腺癌干细胞能在低吸附培养板的无血清培养液中持续传代培养，表现为悬浮、生长的干细胞微球。将乳腺癌干细胞接种于无血清培养液(添加各种生长因子)中，细胞悬浮并形成松散细胞球团，2～8 d时形成进一步增殖的干细胞微球，显微镜下观察发现微球呈圆球体，球内细胞连接紧密，具有折光性，微球间具黏附性。与第2天(刚开始成球的时间)相比，第4 天和第8天的成球直径明显增加，分别是第2天的1.67倍和3.10倍，见图1。

图1 MDA-MB-231乳腺癌干细胞成球实验

2.2乳腺癌干细胞差异miRNA的筛选与验证 通过miRNA微阵列芯片共筛选出131个差异miRNA，其中有56个上调miRNA，57个下调miRNA。图中横行为每个miRNA，纵列为每个样本，颜色从绿到红表示基因表达水平从低到高，并对基因进行了聚类(图2A)。与非乳腺癌干细胞相比，一部分miRNA在乳腺癌干细胞上低表达，其中miR-25的表达在乳腺癌干细胞内显著下调约41%。为验证miR-25对乳腺癌干细胞的影响，在向乳腺癌干细胞培养体系施加miR-25 Mimics提高其表达后，检测ALDH干细胞比例。流式代表性结果显示，Mimics组的乳腺癌干细胞水平显著低于Nc组，表现为ALDH干细胞比例从5.90%跌至0.807%，Mimics组ALDH干细胞比例下调86.32%(图2B)；同时，miR-25可以抑制乳腺癌干细胞的自我更新能力(图2C)。相对于Nc组细胞，无论是哪一代干细胞球，施加miR-25 Mimics后细胞成球能力均显著增强，表现为成球直径明显缩小。具体为：施加miR-25类似物Mimics后，第一代成球直径从Nc组的(356±47)μm缩小至(174±25)μm；将第一代成球通过机械吹打形成单细胞悬液，形成第二代微球施加miR-25类似物Mimics后也发现类似结果，成球直径从(364±16)μm缩小至(200±4)μm。而施加miR-25抑制剂Inhibitor的结果与此相反，Anti-Nc组的第一代和第二代成球直径分别为(330±4)μm和(318±23)μm，施加miR-25抑制剂Inhibitor后成球直径分别变为(472±9)μm和(507±21)μm，Inhibitor组较Anti-Nc组分别增加约42.66%(t=20.246，P=0.002)和59.18%(t=8.453，P=0.014)。

2.3靶基因预测 差异的miRNA按照5个数据库(miRWalk、miRanda、miRDB、RNA22和Targetscan)来预测其靶基因，并选择5个数据库同时支持的结果，去掉重复的共获得4 565个靶基因。

2.4靶基因的GO富集分析 根据分析结果中靶基因显著性功能、所含的基因数目及其在数据库中的富集程度，按照P值排序构建显著性靶基因功能的柱状分布图，包括生物过程、分子功能和细胞组分三类。-LgP值越大表明P值越小，即该靶基因功能显著性水平越高(图中仅显示按照-LgP排序最大的各前10项)。见图3。

2.5靶基因的KEGG富集分析 本研究得到的显著性通路包括肿瘤中的miRNAs、肿瘤通路、促分裂原活化的蛋白激酶信号通路、乳腺癌、细胞衰老、调节干细胞多能性的信号通路、细胞周期、FoxO信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、Ras信号通路、p53信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路、自噬、缺氧诱导因子-1信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路、AMP活化的蛋白激酶信号通路、溶酶体、腺苷三磷酸结合盒转运蛋白、Hedgehog信号通路(图4)。其中，乳腺癌、细胞衰老、调节干细胞多能性的信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、Hedgehog信号通路是乳腺癌干细胞中经典通路；此外，自噬、促分裂原活化的蛋白激酶信号通路、FoxO信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路、AMP活化的蛋白激酶信号通路、溶酶体通路与自噬的发生发展密切相关。

2.6自噬对乳腺癌干细胞的作用 乳腺癌干细胞培养基培养获得悬浮微球状乳腺癌干细胞后，转染2A：miRNA微阵列芯片；2B：施加miR-25类似物Mimics及其阴性对照Nc后，检测MDA-MB-231乳腺癌干细胞中ALDH干细胞比例；2C：向MDA-MB-231乳腺癌干细胞体系中施加miR-25类似物Mimics增加miR-25的表达或施加miR-25抑制剂Inhibitor减少其表达后，检测MDA-MB-231乳腺癌干细胞成球能力的变化；Nc：miR-25类似物对照组；Mimics：miR-25类似物组；DEAB：二乙氨基苯甲醛；SSC：侧向角散射；FITC：异硫氰酸荧光素标记；Anti-Nc：miR-25抑制剂对照组；Inhibitor：miR-25抑制剂组LC3串联荧光蛋白腺病毒，其中绿(GFP)和红(RFP)用于标记及追踪LC3，显微镜成像后红绿荧光叠加后出现的黄色斑点即自噬小体，游离的红色斑点即自噬溶酶体。乳腺癌贴壁细胞、乳腺癌干细胞及重新分化后乳腺癌干细胞的自噬活性程度为乳腺癌干细胞>重新诱导分化贴壁后乳腺癌干细胞>乳腺癌贴壁细胞(图5A)。同时，紫杉醇可明显增强乳腺癌干细胞上自噬流的强度；紫杉醇联用自噬体抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)后乳腺癌干细胞中红、绿荧光均减弱；而紫杉醇联用自噬溶酶体抑制剂氯喹可阻断自噬体与溶酶体融合，仅表现为红荧光减弱，见图5B。观察成球能力发现，对照组、紫杉醇组、紫杉醇+3-MA组和紫杉醇+氯喹组成球直径分别为(338±20)μm、(494±44)μm、(254±16)μm、(226±38)μm。与紫杉醇单药组相比，紫杉醇联用3-MA(t=7.274，P=0.018)或氯喹(t=6.519，P=0.023)均导致成球直径缩小近1/2。

图2 MDA-MB-231乳腺癌干细胞差异miRNA的寻找与验证

2.7miR-25对乳腺癌干细胞自噬的作用 蛋白质印迹法结果显示，紫杉醇可以增加乳腺癌干细胞自噬活性，与空白对照组相比，紫杉醇组的LC3-Ⅱ表达水平升高且p62表达水平降低，见图5C。施加miR-25 Mimics后可引起细胞内自噬水平的降低，表现为LC3-Ⅱ表达水平显著降低，p62表达水平升高。施加miR-25 抑制剂使miR-25表达下调后，乳腺癌干细胞自噬水平明显提高。因TargetScan软件预测miR-25与自噬早期调控基因ULK1之间存在结合互补序列，故通过观察miR-25对ULK1表达的影响发现，与Nc+紫杉醇组相比，Mimics+紫杉醇组的ULK1蛋白表达明显减少，即miR-25可减少因化疗增加的ULK1表达。

3 讨 论

肿瘤干细胞通过自我更新和分化能力维持着肿瘤的无限增殖，从而影响乳腺癌的发生、发展以及转移[2]。研究发现，乳腺癌干细胞对化疗或放疗具有原发耐药性[10]。miRNA在多种病理生理过程中(细胞增殖、干细胞分化、肿瘤形成)具有重要意义[5-6]。因此，高通量芯片鉴定乳腺癌干细胞相关的miRNA将为肿瘤治疗提供新思路。本研究中，利用miRNA微阵列芯片共筛选出了131个与乳腺癌干细胞活性密切相关的差异miRNA。同时，利用多个数据库对差异miRNA进行靶基因预测，将获得的靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。GO数据库又称基因本体学数据库，GO富集分析是通过树状分层的方式对基因及蛋白功能进行详细描述，可筛选出目标基因群的显著性功能[2，10]。KEGGmiRNA：微RNA；KEGG：京都基因与基因组百科全书；Gene number：基因个数；Rich factor：富集因子是系统分析基因(及其编码产物)间关系、基因功能、基因组信息的数据库，可将基因及表达信息作为一个整体网络进行研究[11-12]。本研究结果显示，基于GO和KEGG分别从基因功能和通路分析对差异靶基因生物学功能的解读，提示miRNA影响乳腺癌干细胞活性的重要机制与自噬调控密切相关；同时发现多个显著性信号通路(P≤0.05)，如促分裂原活化的蛋白激酶信号通路、FoxO信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路、AMP活化的蛋白激酶信号通路、溶酶体通路等均与自噬调控密切相关。前期研究表明，自噬可能是miRNA介导肿瘤耐药的重要机制[8]。多条miRNAs，如miR-183、miR-376b、miR-106a、miR-31、miR-34c、miR-30a、miR-23b、miR-375等相继被证明参与了调节肿瘤细胞自噬过程，其中miR-30a、miR-23b和miR-375可通过调节细胞自噬影响化疗药物或放疗敏感性[13-14]。然而，目前自噬对肿瘤干细胞的调节作用及分子机制尚不清楚。有研究表明，自噬抑制可能破坏肿瘤干细胞的相对休眠状态，促使其向肿瘤细胞分化，从而增强肿瘤化疗敏感性[15]。本研究中，乳腺癌干细胞的自噬活性明显高于重新分化后乳腺癌干细胞和乳腺癌贴壁细胞，且施加自噬抑制剂3-MA或氯喹均可削弱乳腺癌干细胞自我更新能力。因此，研究miRNA对乳腺癌干细胞内自噬水平的调控，将为开发乳腺癌干细胞靶向策略提供理想靶标，也对提高乳腺癌的化疗疗效、降低复发转移风险及改善预后和生活质量具有积极意义。

miRNA：微RNA；GO：基因本体论

图4 MDA-MB-231乳腺癌干细胞差异miRNA靶基因的KEGG通路富集分析

目前研究指出，miRNA的异常表达可能与miRNA基因的扩增、缺失、突变或表观遗传调控以及生物合成异常等密切相关[16-18]。本研究中，与非乳腺癌干细胞相比，部分miRNA在乳腺癌干细胞上低表达，其中miR-25是下调最明显的miRNA之一。同时，miR-25可降低乳腺癌干细胞的比例及干细胞成球能力，且与细胞自噬活动密切相关。然而，miR-25的低表达是影响自噬进而影响乳腺癌干细胞自噬的机制还需进一步研究。首先，miR-25与自噬早期调控基因ULK1之间存在结合互补序列，蛋白质印迹法结果揭示miR-25可以明显降低ULK1的蛋白表达。因ULK1激活后可磷酸化BECN1激活含自噬相关蛋白14的Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶复合物，从而诱导自噬早期膜结构的形成[19-21]。故推断，miR-25低表达可通过激活ULK1介导早期自噬，从而影响乳腺癌干细胞干性(如化疗耐药)。其次，利用表遗传学发现miR-25启动子区存在明显CpG岛，推断其异常表达可能与启动子区域DNA甲基化调控有关。miR-25位于易发生miRNA甲基化的热点染色体7q22.1上，在蛋白质编码基因MCM7初级转录本的第13个内含子区，并与另外两种成熟miRNA(miR-106b和miR-93)高度成簇存在于基因组内[17]。Kunej等[17]指出，胃癌中miR-25的表达受其启动子区域DNA甲基化的调控。Tsai等[18]研究发现，使用DNA去甲基化制剂处理AGS胃癌细胞后，miR-25表达水平升高了6.3倍。但对miR-25启动子区甲基化位点分布以及miR-25甲基化对乳腺癌干细胞的作用仍需进一步探索。

综上所述，乳腺癌干细胞与非乳腺癌干细胞之间miRNA存在明显差异表达，其中miR-25的异常表达可能与自噬信号通路密切相关，进而影响乳腺癌耐药进程。