调补肺肾三方对慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌萎缩的疗效评价

沈婷婷，李素云，李亚，卞晴晴

（1.河南中医药大学，河南 郑州；2.呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南 郑州）

0 引言

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种与呼吸道炎症反应增强有关的肺部疾病，其特征性表现为肺泡，气道以及微血管的进行性炎症反应[1]，除累及肺脏外（影响气道重塑以及肺气肿的发生发展）[2]，可引发脑血管疾病，骨骼肌功能障碍，心脏病等全身肺外效应[3]。世界卫生组织将其与心脑血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤以及代谢性疾病合称为全球“四大慢病”[4]。

骨骼肌萎缩作为COPD 主要的肺外并发症之一，常出现在疾病的早期阶段，是患者活动受限的主要原因，也是加快其病情恶化的关键因素，与COPD 患者致残率和死亡率密切相关，影响生活质量与预后[5]。骨骼肌结构与代谢的改变是COPD 患者骼肌功萎缩的主要原因[6]。研究表明，COPD 骨骼肌萎缩患者的肌纤维类型可从氧化型慢肌纤维（I 型）转变为糖酵解快肌纤维（Ⅱ型）[7]，同时伴有肌纤维横截面积的减低[8]。骨骼肌代谢方面，炎症与机体健康状态密切相关，COPD 患者体内多种炎症因子含量的增高可影响多个细胞通路，使蛋白降解速率加快，导致患者骨骼肌萎缩的发生[9-10]。

据研究表明瘦素（leptin,LEP）与促炎症因子如白细胞介素-1（IL-1）和肿瘤坏死因子a（TNF-a）相关[11]。COPD 急性加重期瘦素水平会显著增加，导致疾病过程中患者摄入量减少，代谢加快，出现消瘦、肌无力的症状。补肺健脾方可以显著改善COPD大鼠骨骼肌萎缩，降低LEP 水平有关，其机制可能与下调核因子（nuclear factor，NF）-ҡ B 活性有关[5]。

本研究以香烟烟雾暴露联合细菌感染制备的COPD 大鼠模型为研究对象，观察调补肺肾三方对COPD 大鼠骨骼肌萎缩的疗效评价。

1 材料

1.1动物和细菌

SPF 级SD 大鼠60 只，雌雄各半，体质量（200±20）g，河南省实验动物中心提供，实验动物合格证号：SYXK(豫)2017-0001。肺炎克雷伯杆菌，购自中国生物品检验鉴定所（货号：46114），细菌浓度根据实验所需调整为6×108CFU/mL。

1.2药物氨茶碱片（0.1g/片)，购自河南中医药大学第一附属医院。补肺健脾方（党参15g，黄芪15g，白术12g，陈皮9g，茯苓12g 等，每毫升含生药量2.6496g），补肺益肾方（人参9g，黄芪15g，枸杞子12g，浙贝母9g，山茱萸128 等，每毫升含生药量1.8480g），益气滋肾方（人参9g，黄芪15g，熟地黄15g，构杞子12g，麦冬l5g 等，每毫升含生药量2.0160g）,由河南中医药大学第一附属医院中药制剂实验室提供。

1.3试剂与仪器

红旗渠牌过滤嘴香烟（焦油量：14mg，烟气烟碱量：1.2mg；烟气一氧化碳量：15mg），购自河南中烟工业有限责任公司。水合氯醛由郑州派尼化学试剂公司提供。病理仪器：PM-10AD 光学显微镜及照相系统（Olympus，日本）；Image- ProRPus6.0 专业图像分析系统(Media Cybernetics，Inc，美国）。

2 方法

2.1模型制备

大鼠购回后适应环境7d，实验室室温为（25±1）℃，相对湿度（50±10）%，换气量10-15 次/h，氨浓度≤14mg/m3，噪声≤60db，定期检查净化操作系统，保持环境安静。灭菌饲料喂养，自由饮用灭菌水，采用香烟烟雾暴露联合肺炎克雷伯杆菌反复感染的方法建立COPD稳定期大鼠模型；经鼻腔滴入肺炎克雷伯杆菌液0.1mL，每5天1次，持续8周。给予大鼠香烟烟雾暴露，烟雾通过导管进入300L的烟雾吸入箱内，2次/d，30min/次，2次吸烟间隔至少3h，持续12周。

每周测体重，每月测定肺功能，并根据症状表现、肺组织病理变化、肺功能数据整理分析等确定模型成功与否。

2.2分组与处理

60只SD大鼠按随机数字表法分成对照组、模型组、氨茶碱组、补肺健脾方组、补肺益肾方组以及益气滋肾方组，共6组，每组10只。

自造模后第13周的第1天，对照组和模型组用同等剂量（2mL）的0.9%氯化钠溶液灌胃；氨茶碱组与中药3方组分别给予氨茶碱（2.3mg/kg），补肺健脾方4.84g/kg（0.5g/m L），补肺益肾方4.44g/kg（0.5g/m L），益气滋肾方4.84gkg（0.5g/m L）灌胃，2次/d，共8周。给药剂量需根据每周称取大鼠体质量及时调整。给药至第20周结束后取材。

3 指标测定

3.1肺组织于第20周结束后取材。10%的中性甲醛固定72h，石蜡包埋，4um切片，常规HE染色，通过光学显微镜观察支气管、肺泡病理变化，并根据典型而有意义的病理改变进行图像定量分析。

3.2骨骼肌组织形态学

10%的中性甲醛将骨骼肌组织固定72h，进行石蜡包埋、切片、常规HE染色，在光镜下观察股四头肌的病理变化。

3.3血浆中LEP含量测定

LEP浓度采用酶联免疫吸附试验（EISA）进行测定，单位均为：ng/l。试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，操作过程严格按照试剂盒说明操作，每个指标测3次，取均值。

3.4统计学方法

所有数据采用SPSS 22.0统计分析软件分析处理。组间比较采用单因素方差分析，数据结果以表示。显著性水准取a=0.05。

4 结果

4.1一般情况

模型组大鼠自第2周开始，出现不同程度的躁动、皮毛无光泽，大便溏薄，活动量减少等症状，各组在用药治疗后上述症状均有不同程度的改善，3个中药治疗组中以补肺健脾方组和补肺益肾方组尤为显著。

4.2肺组织病理（见图1）

光镜下观察，对照组肺脏组织大致正常，模型组大鼠肺组织的肺泡间质以及肺支气管可见大量的炎性细胞浸润，部分肺泡壁出现断裂、融合形成气腔、纤维网被破坏，3个中药治疗组和氨茶碱组均可一定程度减轻上述病理改变。

4.3股四头肌病理变化（见图2）

图2 第20周各组大鼠股四头肌病理照片（HE染色）

光镜下观察，对照组股四头肌肌纤维横截大致正常，模型组股四头肌肌纤维横截面积减少伴有一定程度肌纤维的损坏，3个中药治疗组和氨茶碱组肌纤维横截面积较模型组均有所改善，其中以补肺健脾方组较为明显。

4.4LEP水平（见表3）

表3 各组大鼠血浆中LEP的含量s，n=6）

表3 各组大鼠血浆中LEP的含量s，n=6）

注：与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01。

对照组 351.34±67.05模型组 1396.86±299.07**氨茶碱组 570.40±246.71##补肺健脾方组 642.21±290.47#补肺益肾方组 361.44±143.15##益气滋肾方组 478.50±94.96##

Elisa结果显示LEP水平模型组较对照组有明显的升高（P＜0.01），在用药治疗后，3个中药治疗组和氨茶碱组可明显降低LEP水平(P＜0.05，P＜0.01)。

5 讨论

COPD病位在肺，通常可累及到脾和肾；其稳定期属本虚标实，以肺脾肾三脏的虚损较为常见,气（阳）虚、气阴两虚是其病机[12]，主要表现为肺脾气虚证、肺肾气虚证、肺肾气阴两虚证等[13-14]，并据此拟定调补肺肾三方（补肺健脾、补肺益肾、益气养阴滋肾）。多中心、随机对照临床试验表明，对COPD稳定期患者，补肺健脾方能够改善患者肺功能，改善临床症状，提高运动能力和生活质量，延缓和改善骨骼肌萎缩的发生和发展等[15]。

慢性支气管炎、小气道和小动脉重塑、肺气肿等损伤是COPD主要的病理表现，本研究结果表明，经治疗后，较模型组而言，3个中药治疗组和氨茶碱组可明显改善支气管壁增厚、肺泡破裂融合、炎性细胞浸润等表现；其中3个中药组改善肺泡破裂融合较氨茶碱组显著。

骨骼肌萎缩属于中医学“痿症”、“痿壁”等病症的范畴，是一种可以发生于多种疾病和状态的严重并发症，特征是其纤维横截面积，蛋白质含量和强度的降低导致疲劳性增加[16,17]，其机制可能是由于蛋白质降解增加或合成减少或两者兼而有之[18,19]，影响COPD患者呼吸肌肉和外周肌肉的功能、运动能力、健康状态和预后。

LEP是一种由脂肪组织分泌的激素，在调节机体能量代谢、体质量方面起着重要作用[20]，其主要生理功能为抑制摄食、增加能量消耗、维持正常的血脂代谢。COPD是一种以炎性反应为核心的慢性进行性的的疾病，COPD肺部炎性反应“溢出”，可产生全身炎性反应和全身效应[21-23]。COPD骨骼肌萎缩患者由于慢性炎症刺激，炎症介质的增多，导致脂肪细胞上的瘦素mRNA表达增加，从而导致血液循环中瘦素水平升高[24],在COPD急性加重期患者血液循环中随炎症反应的严重程度升高，出现高代谢，低摄入的状况，从而造成患者体内营养入不敷出的现象，使骨骼肌质量和功能大幅下降[25]。本研究表明，3个中药方均可以降低LEP水平，效果优于氨茶碱。

综上所述，调补肺肾三方对COPD大鼠骨骼肌萎缩有明显的疗效，表现为改善肺组织和股四头肌病理损伤，降低LEP水平。