排酸护肾汤防治尿酸性肾病MAPK通路与尿酸相关靶点的研究

易纯 吴雨洁 谢城锋 吴林燕 徐笑容 钟颖 逯晶

慢性尿酸性肾病主要由于机体内嘌呤代谢紊乱且血尿酸水平升高引起的炎症反应导致。目前西医治疗从减少尿酸生成和增加尿酸排泄两方面入手，确实在降低血尿酸水平方面起了重要作用，但在治疗的同时所产生的副作用又在一定程度上加重了患者肾功能损害程度[1]。而在中医，根据其病因病机及临床症状，高尿酸肾病应归属于中医“痹证、历节、淋证、腰痛、虚劳”等范畴。其病因复杂，其病机特点是本虚标实、虚实夹杂，脾肾亏虚为本，湿热瘀血内阻为标。因此，清热祛湿，化瘀泄浊解毒是治疗高尿酸肾病的重要治疗方法，可助肾脏排出代谢产物，对肾功能的改善及延缓肾脏疾病的进展具有良好的疗效。刘劲松[2]等总结的排酸护肾汤，已证实对尿酸性肾病的恢复治疗有非常显著的临床疗效。本研究拟从蛋白分子层面揭示排酸护肾汤的对尿酸性肾病的防治机制，探讨其药物对于尿酸转运及排泄影响的特性，探索其延缓肾脏纤维化的机理，为尿酸性肾病中西医结合的临床治疗策略制定提供有力的科学依据。

1 材料

1.1 动物

80只8周龄SPF等级SD健康雄性大鼠，体质量（250±20）g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2016-0002。保持大鼠饲养环境通风、恒温、安静，定期更换垫料，消毒笼具。对其进行12h灯光照射管制。每只大鼠均给予严格的卡片登记管理。

1.2 药物及试剂

1.2.1 主要药物 排酸护肾汤主要由海金砂15 g，金钱草15 g，土茯苓15 g，猪苓15 g，川芎15 g，丹参15 g，熟地15 g，女贞子15 g组成。煎药方法：水煎。煎药前需浸泡药材，水量约为药材的5倍。头煎时，武火煮沸后文火慢煮30分钟，将药汁倒出后原药渣，加适量温水以上法进行二煎。将两煎液混合均匀，用4层纱布过滤3遍，将滤液置于水浴恒温器上浓缩至浓度相当于含生药1 g/mL。

1.2.2 主要试剂 尿酸（UA）含量检测试剂盒，大鼠尿酸盐转运蛋白1（URAT1）联免疫分析试剂盒，Real-time PCR试剂盒（全式金，货号AQ131-01），兔抗山羊-HRP（中山金桥，货号ZB-2306），肌酐（CRE）、尿素氮（BUN）测定试剂盒（南京建成，货号C011-2、C013-2），黄嘌呤氧化酶（XOD）活性检测试剂盒（Solarbio，货号BC1090）。

2 方法

2.1 分组和给药

取雄性SD大鼠80只，进行完全随机分组，并命名为正常组、模型组、排酸护肾汤组、别嘌呤醇组和联合用药组共五组。建造大鼠动物模型，6天后，即第7天，通过灌胃的方式对每组大鼠进行给药（每天3：00 pm），别嘌呤醇组大鼠别嘌醇50mg/（kg d）灌胃，排酸护肾组120 g（0.018 5/kg）别嘌呤灌胃，正常组使用等体积的蒸馏水，模型组与正常组处理相同，联合用药组均给予，总给药时长为14天，但给药6天后，停止腺嘌呤损害因素。

2.2 尿酸性肾病大鼠模型的制备

正常对照组：普通饲料饲养；模型组：高酵母颗粒性饲料饲养（酵母的每日摄入量10 g/kg），并腺嘌呤100 mg/（kg·d）灌胃。别嘌醇治疗组，联合用药治疗组同模型组一致，灌胃及腹腔注射量均为0.5 mL/100g。各组大鼠自由饮水，称重一周两次。适用性饲养3天后开始造模，每日9：00 am正常组生理盐水灌胃10 mg/（kg·d），持续14天。

2.3 一般情况、体重

对大鼠的摄食、排泄、活动、皮毛变化、刺激反射等一般情况进行观察记录；并于造模前，及造模后7、14、21天称重。

2.4 UA、Cr、BUN和XOD表达水平

在生理盐水（冷）中漂洗组织块（0.2～1.0 g），量取生理盐水或匀浆介质（冷），容量约组织块重量9倍。再次量取，所取量占其总量的2/3，后剪碎组织块，进行超声粉碎，频率为400 A，5 s/次，一定时间间隔（10 s）内反复3～5次。使用普通离心机或低温低速离心机按照2 000 r/min的转速离心制备好的10%匀浆，定时10～15 min。检测上清液UA、Cr、BUN、XOD的表达水平。

2.5 qRT-PCR法测定URAT1基因的表达水平 称取50 mg肾组织加入1 mL Trizol，震荡后置于冰上孵育30 min。加入200μL三氯甲烷摇匀至乳化，12 000g离心15 min 后取上清液，加入等体积异丙醇，置于温度约25℃环境下10 min。将所得混合液在4℃下离心10 min，弃其上清液后加入1 mL70%浓度乙醇溶液，后于4℃下离心5 min。弃去乙醇并在25℃环境下将沉淀产物干燥2～5 min，后加入RNA溶解液适量（如20 μL）使其溶解，搅拌使其溶解完全，加入反转录引物，经过简单的离心、充分振荡混匀后放入水浴锅中，温度设置为70℃，预变性时间为5 min，然后置于冰上2min。最后的PCR扩增阶段需设置反转录程序，引物信息见表1。

表1 引物信息

表 2 排酸护肾汤对UA， Cr， BUN，XOD的浓度的影响 （

表 2 排酸护肾汤对UA， Cr， BUN，XOD的浓度的影响 （

images/BZ_144_213_650_2299_698.png正常组 44.96±14.21 139.11±15.12 7.15±0.32 1.28±0.15模型组 79.23±7.87 529.20±19.27 15.68±0.33 16.95±0.95排酸护肾组 57.36±7.11 423.39±14.46 11.52±0.14 11.72±0.28别嘌醇组 57.29±10.81 393.32±7.24 10.94±0.21 10.88±0.65联合用药组 31.01±2.68 277.84±9.43 8.83±0.24 5.60±0.23

2.6 肾脏p-p38MAPK的蛋白质表达水平

制备肾脏组织匀浆，检测蛋白含量。电泳后电转至PVDF膜上，加入相应一抗密闭孵育4 h，洗涤缓冲液（TBST）洗膜，加入二抗孵育2 h后TBST洗膜，曝光、定影。蛋白质相对表达量用QuantityOne 1.1.1软件进行光密度分析。

3 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件。对计量资料进行组件比较，若数据服从正态分布且各组间方差齐时，则采用LSD法，若数据服从正态分布但各组间方差不齐时，则采用Games-Howell法；若数据不服从正态分布，则采用Kruskal-Walls法。若P＜0.05，则差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般状况观察

随着造模药物排酸护肾汤的使用，各组大鼠发生不同程度体质量增长减缓，精神萎靡不振，饮水量减少，拱背畏寒，毛发干枯、发黄、暗淡无光泽，以及出现逆毛现象。随着治疗药物的应用，排酸护肾组、别嘌呤醇组和联合用药组的大鼠体质量增长，饮水量减少、精神萎靡不振、拱背畏寒、逆毛现象有所好转，动作灵敏，其中以联合用药组效果最好（见图1）。

3.2 排酸护肾汤对UA、Cr、BUN以及XOD的浓度的影响

造模第21天取出大鼠的双侧肾组织，将其制作成肾匀浆，并取上清液测量尿酸浓度。模型组大鼠的尿酸浓度明显高于正常组（t=4.482，P=0.001）；排酸护肾组、别嘌呤醇组和联合用药组的尿酸浓度均低于模型组 （t排-模=-2.860，P排-模=0.017；t别-模=-2.870，P别-模=0.017；t联-模=-6.307，P联-模=0.000），且联合用药组效果优于排酸护肾组和别嘌呤醇组，（t联-排=-3.447，P联-排=0.006；t联-别=-3.437，P联-别=0.006）。造模第21天检测Cr、BUN、XOD浓度，模型组内三者浓度均明显高于正常组，（Cr：t模-正=49.010，P=0.000；BUN：t模-正=57.162；P=0.000；XOD：t模-正=40.008，P=0.000）；同模型组相比，治疗组Cr、BUN、XOD浓度明显下降低于模型组，（Cr：t排-模=-13.294，P排-模=0.000；t别-模=-17.072，P别-模=0.000；t联-模=-31.580，P联-模=0.000；BUN：t排-模=-27.878，P排-模=0.000；t别-模=-31.774，P别-模=0.000；t联-模=-45.864，P联-模=0.000；XOD：t排-模=-12.962，P排-模=0.000；t别-模=-12.962，P别-模=0.000；t联-模=-28.471，P联-模=0.000）。治疗组Cr浓度下降效果依次为联合用药组＞别嘌醇组＞排酸护肾组（t联-别=-14.508，P=0.000；t联-排=-18.286，P=0.000；t别-排=-3.778，P=0.001）；治疗组BUN浓度下降效果依次为联合用药组＞别嘌醇组＞排酸护肾组（t联-别= -14.090，P=0.000；t联-排=-17.986，P=0.000；t别-排=-3.896，P=0.001）；治疗组XOD浓度下降效果，联合用药组效果优于排酸护肾组和联合用药组（t联-别= -18.841，P=0.000；t联-排= -40.796，P=0.000），结果见表2。

3.3 排酸护肾汤对肾组织URAT1表达水平的影响

造模第21天，测量各组大鼠肾组织的URAT1mRNA表达水平。模型组URAT1mRNA表达水平高于正常组（Hc=25.889，P=0.000）。别嘌醇组URAT1mRNA表达水平低于模型组（Hc=-31.111，P=0.000），且别嘌醇组效果优于联合用药组。（Hc=-19.611，P=0.015）。

图1 小鼠体质量随时间变化折线图

图2 排酸护肾汤对MAPKAPK-2和p38MAPK的影响

3.4 排酸护肾汤对MAPK信号通路相关蛋白水平的影响

造模第21天，对肾组织MAPK信号通路的MAPKAPK-2、p38MAPK蛋白进行测定。结果显示，模型组的MAPKAPK-2、p38MAPK蛋白含量较正常组明显升高，这说明造模成功，排酸护肾组MAPKAPK-2、p38MAPK蛋白含量明显低于模型组，但略高于别嘌呤醇组和联合用药组。这表明排酸护肾汤可以通过MAPK信号通路对尿酸性肾病进行治疗。结果见图2。

4 讨论

排酸护肾汤由常用排石药及护肾药组成。海金沙、金钱草、土茯苓主要具备清利湿热的功能，以达消石利尿之效，辅之以丹参、川芎以活血理气，以活血通络，减轻炎症反应，熟地、女贞子补肾固本，以改善肾功能。本方除应用利水化湿药物，可促进尿酸排泄外，少佐几味活血化瘀药，能够扩张血管改善肾脏循环，又能预防肾间质纤维化，减少炎症细胞对肾小管及肾间质的损伤。临床数据也证实其治疗痛风、尿酸性肾病有独特的疗效，数十年间已积累大量成功有效的案例。

慢性肾病患者常出现高尿酸血症，并伴有血清Cr和BUN升高[3-4]。以往的其他研究报告表明，别嘌呤醇明显阻断高尿酸血症大鼠的肾功能改变，并且降低患者的Cr和UA水平[5-6]。在本研究中，酵母和腺嘌呤诱导的尿酸性肾病大鼠模型可见Cr、BUN明显上升。但在排酸护肾汤作用之后，这两个指标显著降低，预示造成肾脏损伤的物质得到控制，肾功能得到一定程度的改善。同时，联合用药比单独使用排酸护肾汤或别嘌呤醇对Cr、BUN、XOD三组指标的作用更大，提示临床可以通过联合用药起到改善疗效的目的。

Richette P等[7]报告90%以上的尿酸性肾病是由尿酸排泄受损引起的。尿酸转运体基因URAT 1对UA在人体内的再吸收起着重要作用。此外，它也是一种药物靶点，可被尿酸类药物如苯溴马龙和丙磺舒所抑制[8]。在本研究中，成功诱导的尿酸性肾病小鼠体内URAT 1基因表达增强。经排酸护肾汤治疗后，URAT 1 的mRNA表达明显下降。这些结果表明，排酸护肾汤可能在减少尿酸盐的再吸收中发挥作用，这一作用主要通过抑制URAT1基因的表达发挥作用。

MAPK通路包括ERK、JNK和p38这一类的丝氨酸/苏氨酸激酶家族[9-10]，MAPK的激活对应激诱导的细胞凋亡有一定的促进作用[11-12]，最终导致肾脏的纤维化。本研究结果表明，造模成功的小鼠体内可见p38磷酸化。排酸护肾汤也被观察到抑制MAPK的激活，这表明排酸护肾汤通过MAPK信号通路减少氧化应激诱导的上皮细胞凋亡，从而有效缓解肾脏纤维化。

综上所述，对于尿酸性肾病大鼠模型，排酸护肾汤可通过减少Cr，BUN，XOD的含量来改善肾功能，其作用于尿酸转运蛋白URAT1减少尿酸的重吸收，并且通过抑制MAPK通路来抑制炎症反应，减轻肾脏纤维化。