口腔拭子DNA 在物证袋中转移问题的研究

王青松，刘泉

（1.湖北警官学院刑事技术与情报系2015级本科生，湖北 武汉；2.湖北警官学院刑事技术与情报系教师，湖北 武汉）

0 引言

口腔拭子中含有大量的DNA，目前已经成为我国案件中的主要生物物证检材。尤其在刑事案件中，口腔拭子会伴随着杯子、烟蒂等遗留在形式犯罪现场，成为侦查人员突破案件的关键。在提取运输过程中，口腔拭子DNA 会在运输途中转移到物证袋上。不同的物证袋来装载样本会让DNA 的转移量不同。随着运输时间的不同，口腔拭子样本与物证袋之间的DNA 的转移量也不相同，即便是微量的DNA 转移也有可能会造成STR 分型的不全或缺失，导致检测难度加大。这类生物物证检材成为近年来法医学DNA 分析领域的热点和难点。我国研究更多的是对于DNA 提取、定量、扩增的过程进行研究，通过对检材本身进行控制，来达到减少DNA 丢失的可能性。对于检材保存和保存时间的变化的研究相对较少。当现场条件有限，在现场取得的拭子样本应该放置在什么物证袋中能够减少口腔拭子DNA 的转移。在刑事案件侦破过程中，提取证据往往需要花费大量的时间，不同保存时间口腔拭子DNA 遗失的速率也不一样，所以本课题组在2019 年5 月制备制备口腔拭子9 个，分成6 h 组、24 h 组和48 h 组，研究口腔拭子在不同时间不同物证袋中DNA 的量如何变化，从保存生物检材方面来降低口腔拭子DNA 的转移率。

1 材料与方法

1.1 实验材料

塑料物证袋（1 2 c m×1 5 c m）1 0 个，纸质物证袋（1 2 c m×1 5 cm）10 个，用无菌棉签刮擦口腔内壁获得的唾液DNA，夹子若干，标签纸，物证袋封口膜若干。

1.2 主要仪器与试剂

中德美联AGCU-EX22 扩增试剂盒，中德美联AGCUEX22 测序试剂盒，9947A 试剂，蛋白酶K（Merck 公司，德国），DL-Dithiothreitol，Mastercycler pro Eppendorf®热循环仪（Eppendorf 公司，德国），ABI 3500 遗传分析仪。

1.3 方法

1.3.1 实验质量控制

在进行每次实验前，对部分实验仪器和实验材料进行擦洗或浸泡，所用试剂为0.05%的次氯酸和70%己醇，在对部分实验仪器和实验材料进行干燥，干燥时需在无菌的无纺布上进行，并用紫外灯照射至少24 h 以上。随机选取5 个纸质物证袋和5 个塑料物证袋以及5 根棉签，然后对所选取的检材进行DNA 提取、定量、扩增和毛细管电泳，检测结果均为阴性[1]。

1.3.2 不同时间段的口腔拭子DNA 样本的制备

取3 根无菌棉签同时在志愿者口腔内壁上擦拭，将1 根放入纸质物证袋，1 根放入塑料物证袋，6 h 后分别从2 个物证袋中拿出，用夹子悬空放置，另1 根用夹子夹住用来计算总体DNA 的量，用于对照，并用便签纸分别对每根棉签和物证袋进行标注。以此方法分别设立3 组，棉签放入物证袋中的时间分别为6 h、24 h、48 h，分别放入干燥避光的地方。

1.3.3 检材检验过程

实验过程中，保持实验室温度为（23±1）℃，空气相对湿度保持为50%左右。使用Chelex-100 法对已经进行处理好的口腔拭子样本进行DNA 提取。将用来计算全部DNA量的棉签用手术剪剪碎棉签全部头部，加到含适量纯水的EP管中，用记号笔标记为A，向沉渣悬液中Chelex-100～400 μL，同时加入80 μL 蛋白酶K（10 mg/mL）及20 μL DTT，轻轻混匀，以相同方法分别制备放入纸质物证袋中的棉签、纸质物证袋将棉签接触部位、塑料物证袋将接触棉签部位、塑料物证袋中的棉签并分别标记为B、C、D、E。将5 份检材用56 ℃孵育30 min，后高速振荡20 s，再用100 ℃加热8 min。取出，振荡15 s，12000 rpm 离心3 min，在4 ℃条件下取上清液用于PCR 扩增。其余几组样本用同样方式进行DNA 提取。24 h 样本按照6 h 样本制取方法依次标记为A1、B1、C1、D1、E1。48 h 样本按照6 h 样本制取方法依次标记为A2、B2、C2、D2、E2。

配置10 μL 体系扩增试剂，在EP 管中加入MIX 试剂4 μL，再加入primer 2 μL，水2.6 μL，酶0.4 μL，以同体系配置9 份，将提取所得到的上清液样品每份样品及阳性对照、阴性对照各取1 μL 加入到配置好的试剂管中。按照试剂盒程序进行扩增。待扩增完毕，放入ABI 3500 测序仪进行测序。

1.3.4 数据分析

统计3 组实验模板STR 分型图谱所得出峰高来确定全部DNA 定量结果，将所测得的DNA 量以转移率的形式进行表述。注意观察每一个图谱的电子内标。通过将物证袋上提取到的口腔拭子DNA 的量和样品上提取到的口腔拭子DNA 的量与物证袋上提取到的口腔拭子DNA 的量之和进行对比来计算转移率（转移率=物证袋提取到的口腔拭子DNA量/物证袋提取到的口腔拭子DNA 量+样品提取到的口腔拭子DNA 量）。将所得STR 分型图谱与已知分型结果比对，当等位基因峰高＞50 RFU 者为有效分型结果。通过将检测到的纸质物证袋与塑料物证袋与袋内棉签DNA 总量与用来用作对照的棉签DNA 总量进行对比来计算检测率（检测率=物证袋和袋内棉签DNA 总量/对照用的棉签DNA 总量）。

2 结果

2.1 不同时间不同物证袋DNA 峰值

本实验每个STR 分型图谱均为单独个体，样品STR 分型图谱峰值中有纯合子峰值达到200 rfu 以上以及杂合子等位基因峰值均在200 rfu 以上的基因座标记为成功检出；当样品图谱峰值低于200 rfu 的基因座标记为未检出。通过对D3S1368 等22 个STR 基 因 座 进 行 分 析，6 h 样 本A 中TH01 这对等位基因峰值达到32127，B 中TH01 峰值最高为17732，C 中TH01 峰 值 最 高 为2496，D 中D2S1338 等位基因中峰值最高为845，E 中TH01 等位基因峰值最高为11232。24 h 样本中A1 中TH01 峰值最高为14476，B1 中TH01 峰值最高为7713，C1 中TH01 峰值最高为1404，D1中TH01 峰 值 最 高 为894，E1 中TH01 峰 值 最 高 为10560；48 h 样本中A2 中D19S433 等位基因峰值最高为62910，B2中D19S433 峰值最高为41330，C2 中D19S433 峰值最高为8730，D2 中峰值最高的是TH01 为5030，E2 中D19S433 峰值最高为52360，详细情况见表1。

表1 口腔拭子在纸质物证袋和塑料物证袋中DNA 峰高值

2.2 不同时间各个样本的转移率

通过转移率的公式计算可以得出，6 h 样本中纸质物证袋的转移率为12.34%，塑料物证袋的转移率为6.70%，塑料物证袋的转移率比纸质物证袋的转移率低。24 h 的样本中纸质物证袋的转移率为15.40%，塑料物证袋的转移率为7.81%，48 h 的样本中纸质物证袋转移率为17.44%，塑料物证袋的转移率为8.76%。通过样本检测率的公式计算得出，6 h 样本中纸质物证袋的检测率为37.04%，塑料物证袋的检测率为62.41%；24 h 样本中纸质物证袋的检出率为38.30%，塑料物证袋的检测率为22.48%；48 h 样本中纸质物证袋的检测率为20.43%，塑料物证袋的检测率为8.77%，见图1。

图1 不同时间段唾液在纸质物证袋和塑料物证袋转移率

3 讨论与分析

DNA 接触转移在法医物证研究中占有重要地位，其中二次转移更是近年来被法医学者们越来越多的谈论[2-3]。Mariya Goray 等人模拟常规刑事案件提取检材对170 个手套上二次转移的DNA 进行了研究，发现有131 个手套上检出高于阈值的等位基因，说明二次转移在法医学实践中非常常见[4]。浙江警察学院的学者通过对9 名志愿者在洗手后30 min、2 h、6 h 分别握持木柄螺丝刀、橡胶柄螺丝刀、胶木插头1 min 和佩戴粗纱手套15 min，及手部脱落细胞的二次转移实验发现，在洗手后30 min 和2 h 后，从手套中检出11～16个基因座的人数为26 人，明显多于从木柄检出的14 人和橡胶柄螺丝刀中检出的14 人，说明不同类型的客体DNA 的转移率是不一样的。本实验与以往研究不同的是，研究了同种物证在不同物证袋上DNA 的转移情况以及随着时间变化，不同时间段的检材的转移情况会有何不同。实验结果显示，所有放在物证袋中的棉签均发生了DNA 转移，但不同的物证袋在相同时间内，DNA 的转移率不同，同一物证袋在不同时间下，DNA 的转移率也不相同。

从实验结果比较它们的转移率可知，放入纸质物证袋中的口腔拭子DNA 转移率三个时间段都要比塑料物证袋中的口腔拭子DNA 转移率会高。原因可能是塑料物证袋是非渗透性材质，而纸质物证袋材质是渗透性材质。Gosch Annica[5]通过研究带塑料柄的螺丝刀和带涂层钢制的撬棍也有类似发现，带塑料柄的螺丝刀STR 基因座DNA 转移发现率高达90%，带涂层钢制的撬棍STR 基因座DNA 转移发现率10%，渗透性客体的DNA 转移率明显高于非渗透性材质。

实验结果还显示纸质物证袋中的DNA 量随着时间增长在变多，纸质物证袋中的DNA 的转移率在3 个时间段里也逐步增大；塑料物证袋3 个时间段塑料物证袋的DNA 转移率有轻微的上升，但总体上基本保持不变。这可能是塑料物证袋不透气，不利于样品的保存从而导致DNA 降解加速的原因。这说明在犯罪现场如果遇到较为新鲜的生物物证，装在塑料物证袋中比装在纸质物证袋中更容易减少DNA 的转移。而在实际工作中，如果遇到微量DNA，为防止这些微量物证丢失，导致侦破案件难度加大[6]，建议选择纸质物证袋保存，这将有利于提高后期的检出率。

实验结果还显示同一时间段，同一组样品中纸质物证袋与纸质物证袋中的棉签中含有的DNA 总量和塑料物证袋与塑料物证袋中棉签上含有的DNA 总量要比实际测得的用作对照的棉签DNA 总量少（表1）。笔者分析，其原因可能有以下3 点：第一，这是因为在制备DNA 检材过程中，用眼科手术剪剪取棉签纤维时只剪取了棉签表层，会有部分DNA 丢失。第二，同时物证袋样本在制备过程中因为EP 管较小，只剪取了棉签头放入的一部分，所以也有可能造成DNA 缺失。第三，也有可能在采用直接剪取法剪取物证袋时手套上或者是剪刀上也会沾染上DNA，导致实际物证袋和放入物证袋中棉签的DNA 量加起来比对照组用来测量DNA 总量的棉签含量低。这个现象提示我们在提取DNA 时要注意提取全面，同时法医人员在运送检材时要注意检材在物证袋中的移动，避免DNA 转移量增大。笔者在进行实验的过程中，发现会有个别组的样本STR 分型图谱跑不出，当同比稀释之后，可以跑出正常的STR 分型图谱。实际案件中一般只需要一小部分实验检材能够得出DNA 的分型图谱，大量的DNA 容易导致峰值过高甚至DNA 测序仪测不出具体峰值。3 组时间段用来得出DNA 总量的棉签DNA 量都不同，这与每次制备样本时有关，样本制备时用棉签擦取口腔内壁的力度次数都影响DNA 的含量。横向分析可以看出，3 组实验效果都比较明显，能检验出大量的STR 基因座，说明当检材新鲜时，检材内含有的DNA 量大，提取难度低、条件好时可采用Chelex-100法提取接触DNA，能够很好的发挥其优势，尽量避免检查方法对结果产生影响。

本实验得出的结果中，发现48 h 塑料物证袋的检测率异常低，其他样品的检测率属于正常值。这种情况可能是因为在进行DNA 提取时没有把物证袋上含有DNA 的范围剪取全面造成DNA 遗失。3 个时间段的纸质物证袋中的遗失率都比塑料物证袋的遗失率高，此种现象暂时无系统解释，有待进一步研究。

通过STR 分型图谱可以看出6 h 样本中存在有污染情况，存在污染的情况有很多种，可能有制备样本时的污染，有可能是转移过程中没有做到绝对的防污染[7]，另一方面，实验室潜在的污染是对DNA 分型存在污染的进一步的解释，即使在DNA 提取过程中用了所有能够避免污染的材料，我们仍需要设定阴性对照和阳性对照来专门针对样本管特异性污染。如今法医界有不少学者对污染的各种不同类型和检测情况都进行过讨论，并对污染造成的潜在影响进行评估，包括依据指南对STR 分析结果的解释、最终获得的数据等[8]。随着科技发展，也许有一天能够创立一个评估系统能够对污染造成的假阳性结果进行评估和能够移除常规和LCN 模板证据处理中的危险因素，以及创立对阴性对照进行分析的应用专家系统。

4 结论

通过对实验数据进行分析，可以得出以下结论：（1）口腔拭子DNA 在纸质物证袋和塑料物证袋中都会发生转移；（2）同一时间下，塑料物证袋中口腔拭子DNA 的转移率比纸质物证袋中的转移率低；（3）随着时间推移，口腔拭子DNA 在纸质物证袋中转移量增大，而在塑料物证袋的转移量基本不变。由此可以得出塑料物证袋比纸质物证袋更适宜装口腔拭子类生物物证。