基于NF-κB信号转导通路探讨加味补阳还五汤对肺纤维化小鼠的治疗作用

杨善军 祝鹏宇 王 玥 曲齐生 曲 阳 邢露茗 封 笑 肖 洋 樊 蓉

(黑龙江中医药大学附属第二医院1肺病科， 2针灸二病房， 3内分泌老年病科， 哈尔滨 150001)

肺纤维化是指正常的肺部解剖结构被活跃的重塑过程，其特征为上皮细胞损伤，成纤维细胞积聚，过度胶原沉积和基质重塑，导致肺泡结构丧失，肺功能进行性衰退，并最终导致死亡[1-3]。肺纤维化进展缓慢，是高度致命的临床事件[4-5]。肺纤维化影响我国约15万人，近年来发病率和死亡率均稳步上升，没有进行非移植的肺纤维化患者中位生存时间约为3年[6]。炎症反应与肺纤维化密切相关，在肺纤维化早期阶段给予肺纤维化有效治的抗炎治疗如：白细胞介素4和干扰素(IFN)，可减缓肺纤维化进展。核因子-κB(NF-κB)是一种转录因子，其在许多负责产生炎症介质的基因的调节中起重要作用，p65是NF-κB重要基团，研究证实NF-kB可调节纤维化过程中的Th2型免疫反应，促进Th2细胞因子IL-4增加[7]。加味补阳还五汤包括黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁、虎杖、丹参、沙参，其中黄芪味甘微温，入肺脾经，功能补中益气，主治内伤劳倦；虎杖具有清热解毒、祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰的功效；丹参、川芎行瘀血敛新血，祛瘀生新；赤芍养阴润肺，治肺燥咳嗽，助黄芪润肺之功。全方标本兼治，共奏益气养阴、清热解毒、化瘀祛痰之功[8]。本研究探讨加味补阳还五汤对肺纤维化小鼠的治疗作用及加味补阳还五汤各剂量组在小鼠肺组织中NF-κB p65 mRNA和蛋白表达，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物及分组BALB/cJ小鼠120只，2～3周龄，体质量22～25g，贵州医科大学动物试验中心提供[许可证号：SCXK(黔) 20170012，合格证号：SCXK(黔) 20181014]，随机分成6组：对照组、模型组、强的松组(40.0 mg/kg)、加味补阳还五汤低、中、高组(10.0、20.0、40.0 mg/kg，预试验求出加味补阳还五汤对肺纤维化小鼠的ED50为320.0mg/kg，以1/2 ED50为高剂量，2倍间距求出中、低剂量)雌雄各半。动物喂养环境为昼夜循环(12/12 h)，室温(22±1)℃；所有动物自由摄取饲料、自由饮水。

1.2 药物、仪器 及试剂注射用盐酸博莱霉素(规格：20 mg：5 mL；日本化药株式会社高崎工厂，H20090885)，仙琚醋酸泼尼松片(浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字H33021207)、加味补阳还五汤由黑龙江中医药大学附属第二医院饮片药局提供(根据成人剂量公式换算，小鼠用药量为成人的20.13倍，以10.0 mL/kg体质量灌胃，将药液浓度配制成为8 mg/mL)。TRIzol(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)、QuantiTest SYBR Green RT-PCR Kit(Toyobo Co，Ltd，Tokyo，Japan，56985)、NF-Kb P65一抗(目录号13379)和GAPDH(目录号2118)抗体购自Cell Signaling Technology，Inc，Danvers，MA，USA)。抗兔(cat.no.sc-2054)二抗购自Santa Cruz Biotechnology，Inc、蛋白质裂解缓冲液(Pierce；Thermo Fisher Scientific，Inc)、二辛可宁酸蛋白质测定试剂盒(Pierce；Thermo Fisher Scientific，Inc)、HYP、IL-4、TNF-α试剂盒购于上海邦奕生物科技有限公司(ZA3654987、MN147698、LO548598)，FX-96实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)、MK3酶标仪(美国热电)。

1.3 小鼠肺纤维化模型的制备模型组、强的松组、加味补阳还五汤各剂量组小鼠在清醒状态下，将其放入与雾化器相联的30 cm×30 cm×20 cm透明有机玻璃盒中，通过雾化管向盒内喷入雾化的5 g/L(50%)博莱霉素稀释液；每次放入4只；雾化总时间为3 h，每次雾化15 min后，间断5 min再次雾化[9]。对照组以等量0.9%氯化钠注射液雾化，造模方法同前。造模后第2 d起给予0.9%氯化钠注射液灌胃(0.2 mL/20 g)；模型组于造模后第2天起给予0.9%氯化钠注射液灌胃(0.2 mL/20 g)；强的松组及加味补阳还五汤各剂量组分别于造模后第2 d起给予醋酸强的松混悬液(0.32 mg/mL)、以及各剂量的加味补阳还五汤(10、20、40 mg/mL)灌胃，连续14 d。试验结束后，处死小鼠，获取肺组织进行后续研究。

1.4 小鼠肺泡炎级别、肺纤维化级别评分的影响肺组织病理形态学观察(HE染色)：将左肺常规切片4μm HE染色，进行光镜下观察肺组织病理改变。Szapiel 评分方法判定肺泡炎和肺纤维化程度[10]。肺泡炎分级：0级示正常肺泡形态，计1分；Ⅰ级示轻度肺泡炎，计2分；Ⅱ级示中度肺泡炎，计3分；Ⅲ级示重度肺泡炎，计4分。肺纤维化分级：0级示正常肺组织，无纤维化；Ⅰ级示轻度纤维化，受累面积<20%，纤维化累及胸膜、胸膜下肺间质，肺泡结构发生紊乱；Ⅱ级示中度纤维化，病变范围约占全肺 20%～50%，肺纤维化区域从胸膜开始延伸，但仍属局部性；Ⅲ级示重度纤维化，病变范围>50%，并有融合，可见大小不等的囊气腔，并伴有广泛肺实质结构紊乱。

1.5 小鼠肺组织NF-κB p65 mRNA水平的测定用TRIzol(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)提取总RNA提取RNA。QuantiTest SYBR Green RT-PCR Kit(Toyobo Co，Ltd，Tokyo，Japan)用于通过一步qRT-PCR测试基因表达。20 μL qRT-PCR体系为：10 μL 2×QuantiTect SYBR Green RTPCR Master Mix、1.0 μL正向和反向引物(0.5 μm/L)、2 μg模板RNA、0.5 μL QuantiTectRT Mix和ddH2O。引物序列为：NF-κB p65正向，5′-GTCCATCTT CCAGTACAGTGTTG-3′，反向，5′-AGCCATCTTTACCAGACAGTGT-3′;GAPDH正向，5′-GTGGACCTGACCTGCGTCT-3′和反向，5′-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3′。PCR条件为：95℃预变性15 min，然后40个循环，每个循环包含94℃变性15 s，60℃退火30 s和72℃延伸30 s。在ABI ViiATM 7荧光定量聚合酶链式反应(PCR)循环仪上检查基因表达。使用2-ΔΔCt方法检测NF-Kbp65 mRNA水平。GAPDH mRNA水平用于检测mRNA水平的标准化。

1.6 小鼠肺组织NF-Kbp65 蛋白水平的测定将10 mg肺组织用蛋白质裂解缓冲液(Pierce; Thermo Fisher Scientific，Inc)裂解。温育20 min后，将组织裂解物离心后，用二辛可宁酸蛋白质测定试剂盒(Pierce；Thermo Fisher Scientific，Inc。)测量蛋白质浓度。通过10%SDS-PAGE分离总共50μg等份的裂解物并转移到聚偏二氟乙烯膜上。用含有0.05%Tween 20的Tris缓冲盐水(pH7.4)中的5%干燥脱脂乳封闭膜。根据制造商的方案，依次与初级(稀释，1∶200)和辣根过氧化物酶偶联的二级(稀释，1∶5 000)抗体一起温育。使用增强的化学发光蛋白质印迹底物(Pierce；Thermo Fisher Scientific，Inc)和Chemidoc XRS凝胶文献系统(Bio-Rad Laboratories，Inc，Hercules，CA，USA)使目的蛋白质可视化。

1.7 酶联免疫吸附检测(Elisa)大鼠肺组织中HYP、IL-4、TNF-α蛋白水平称取大鼠肺组织，制成匀浆，收集上清液，检测HYP、IL-4、TNF-α蛋白水平。

2 结果

2.1 加味补阳还五汤对小鼠肺泡炎级别、肺纤维化级别评分的影响与对照组比较，模型组肺泡炎级别、肺纤维化级别明显升高(P<0.05)；与模型组比较，强的松组、加味补阳还五汤各剂量组肺泡炎级别、肺纤维化级降低(P<0.05)，且随着加味补阳还五汤给药剂量的增加，肺泡炎级别、肺纤维化级别逐渐降低(P<0.05)；与强的松组相比，加味补阳还五汤低、中剂量组肺泡炎级别、肺纤维化级升高(P<0.05)；高剂量组肺泡炎级别、肺纤维化级无明显变化(P>0.05)，见表1。

2.2 加味补阳还五汤对各组小鼠肺纤维化的影响对照组肺组织结构正常；模型组肺泡腔可见大量炎症细胞浸润，大量胶原纤维渗出；强的松组及加味补阳还五汤高剂量组可见炎症细胞浸润减少，胶原纤维渗出减少；加味补阳还五汤低、中剂量炎症细胞浸润仍明显，胶原纤维渗出较对照组略微减少,见图1。

表1 加味补阳还五汤对小鼠肺泡炎级别、肺纤维化级别评分的影响

注：与对照组比较，*P<0.05； 与模型组比较，&P<0.05； 与强的松组比较，#P<0.05； 与加味补阳还五汤低剂量组比较，☆P<0.05； 与加味补阳还五汤中剂量组比较，△P<0.05。

A： 对照组

B： 模型组

C： 强的松组

D： 加味补阳还五汤低剂量组

E: 加味补阳还五汤中剂量组

F: 加味补阳还五汤高剂量组

图1 加味补阳还五汤对各组小鼠肺纤维化的影响(HE ×400)

2.3 各组小鼠肺组织NF-κB p65 mRNA、NF-κB p65蛋白表达比较与对照组比较，模型组肺组织NF-κB p65 mRNA、NF-κB p65蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，强的松组、加味补阳还五汤各剂量组肺组织NF-κB p65 mRNA、NF-κB p65蛋白表达水平降低(P<0.05)，且随着加味补阳还五汤给药剂量的增加，肺组织NF-ΚBp65 mRNA、NF-κB p65蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)；与强的松组相比，加味补阳还五汤低、中剂量组肺组织NF-κB p65 mRNA、NF-κB p65蛋白表达水平升高(P<0.05)；高剂量组肺组织NF-κB p65 mRNA、NF-κB p65蛋白表达水平无明显变化(P>0.05),见表2、图2。

表2 各组小鼠肺组织NF-ΚBP65 mRNA、NF-κB p65蛋白表达水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05； 与模型组比较，#P<0.05； 与强的松组比较，&P<0.05； 与加味补阳还五汤低剂量组比较，☆P<0.05; 与加味补阳还五汤中剂量组比较,△P<0.05。

注：A，对照组；B，模型组；C，强的松组；D，加味补阳还五汤低剂量组；E，加味补阳还五汤中剂量组； F，加味补阳还五汤高剂量组。

图2 加味补阳还五汤对小鼠肺组织NF-κB p65蛋白表达水平的影响

2.4 各组小鼠肺组织HYP、IL-4、TNF-α蛋白表达比较与对照组比较，加味补阳还五汤各剂量组HYP、IL-4、TNF-α蛋白表达明显升高(P<0.05)；与模型组比较，加味补阳还五汤各剂量组HYP、IL-4、TNF-α蛋白表达明显降低(P<0.05)，且随着加味补阳还五汤给药剂量的增加，HYP、IL-4、TNF-α蛋白表达逐渐降低，剂量-效应关系明显(P<0.05)；与强的松组相比，加味补阳还五汤低、中剂量组HYP、IL-4、TNF-α蛋白表达明显升高(P<0.05)；高剂量组HYP、IL-4、TNF-α蛋白表达略微升高(P>0.05)。见表3。

表3 各组小鼠肺组织HYP、IL-4、TNF-α 蛋白表达水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05； 与模型组比较，&P<0.05； 与强的松组比较，#P<0.05； 与加味补阳还五汤低剂量组比较，☆P<0.05; 与加味补阳还五汤中剂量组比较,△P<0.05。

3 讨论

一般认为肺痿是最恰当的肺纤维化的中医病名，肺痿是肺部反复感染，燥热熏灼，邪气稽留，宣肃不彻，久咳伤肺，渐生痰浊等病理产物瘀阻于肺或其他疾病误治之后重伤津液，导致肺失濡润而成。外邪入侵人体，留滞肺内，损害肺脏，造成肺气亏虚，令气失所主，肺为气之主，肾为气之根，肺病虚损，病久及肾，则肾气虚弱，不能纳气归元，气浮逆于上，则为喘促，动则尤甚。加味补阳还五汤具有益气补肺、活血祛瘀的功效。已有研究表明，加味补阳还五汤减弱了CCl4诱导的大鼠肝纤维化，加味补阳还五汤通过拮抗氧化应激，抑制人肺成纤维细胞中的迁移，增殖和肌成纤维细胞转分化，并减弱肺泡上皮中的上皮-间质转化而干扰肺纤维化[11]。本研究结果表明，与对照组比较，模型组肺泡炎级别、肺纤维化级别明显升高；与模型组比较，强的松组、加味补阳还五汤各剂量组肺泡炎级别、肺纤维化级降低，且随着加味补阳还五汤给药剂量的增加，肺泡炎级别、肺纤维化级别逐渐降低；与强的松组相比，加味补阳还五汤低、中剂量组肺泡炎级别、肺纤维化级升高；高剂量组肺泡炎级别、肺纤维化级无明显变化。这说明，加味补阳还五汤能明显抑制小鼠肺纤维化程度，其高剂量效果与强的松相似，而本研究的病理结果也证实了这一结论。

在肺损伤期间，NF-κB被炎性细胞和活性氧物质持续激活，刺激细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8的转录，最终导致成纤维细胞的增殖[12-13]。因此，NF-κB在肺纤维化的发展和进展中是重要的。NF-κB是由Rel蛋白家族的p65和p50亚基组成的转录因子，但只有p65有激活基因转录的功能[14]。正常情况下，NF-κB与其抑制剂结合，以无活性状态存在于巨噬细胞、气管和肺泡上皮细胞内，不发生作用[15]。在肺纤维化过程中，细胞受到各种炎性刺激，细胞内核因子κB抑制剂被降解，核因子-κB释放激活并发生作用，使受其调控的肺泡巨噬细胞、转化生长因子-β1、血管紧张素(AngⅡ)、成纤维细胞等多种细胞因子基因表达增加，导致其过度增生和增多，最终导致了肺纤维化[16-18]。本研究显示，模型组肺NF-κB p65的表达显著高于对照组，这说明，博莱霉素激活肺组织分泌NF-κB p65。给予加味补阳还五汤后，加味补阳还五汤各剂量组的NF-κB p65表达的降低。这些结果表明，加味补阳还五汤的抗炎和抗纤维化作用是由于降低NF-κB p65表达，发挥了肺泡巨噬细胞、AngⅡ、成纤维细胞等抑制成纤维细胞增殖的作用。

本研究同时探讨了加味补阳还五汤对NF-κB p65下游炎症因子IL-4、TNF-α及纤维因子HYP的影响，结果提示与模型组比较，加味补阳还五汤各剂量组HYP、IL-4、TNF-α蛋白表达明显降低，且随着加味补阳还五汤给药剂量的增加，HYP、IL-4、TNF-α蛋白表达逐渐降低，剂量-效应关系明显。这说明加味补阳还五汤可以抑制博莱霉素诱导小鼠肺纤维化，其机制与加味补阳还五汤抑制NF-κB p65活化，继而抑制炎症因子及纤维因子的表达有关。