睡莲酚对H2O2致LO2细胞损伤的保护作用

姑丽巴哈尔·艾木都拉， 张石蕾， 刘 涛， 姚雨含， 赵 军

(新疆医科大学1药学院； 2公共卫生学院， 乌鲁木齐 830011； 3新疆维吾尔自治区药物研究所维吾尔药重点实验室， 乌鲁木齐 830004)

雪白睡莲(NymphaeacandidaPresl)为睡莲科睡莲属草本植物的干燥花蕾[1]，研究表明睡莲酚(isostrictiniin)是其主要的化学成分[2]，具有降热养肝、清热补心、湿脑安神、消炎止咳、保护肝脏等功效，临床上主要用于热性感冒、干热性脑虚、肝虚、心虚的治疗[3-5]。本课题前期研究发现睡莲酚对半乳糖胺、刀豆蛋白A和四氯化碳诱导的免疫性和化学性肝损伤均有良好的治疗作用[6-9]。本研究采用过氧化氢(H2O2)致LO2细胞氧化应激损伤模型，研究睡莲酚对LO2细胞的保护作用，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器Multiskan GO型自动酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；BA210型倒置显微镜(德国Mtic公司)；BCD-275TMBC型超低温冰箱(青岛海尔股份有限公司)；Heracell型CO2恒温培养箱(美国赛默飞公司)；KS12型超净工作台(美国Thermo Scientific公司)；HHW420型恒温水浴锅(深圳市博大精科技实业有限公司)；AB104-N型电子天平(上海梅特勒托利多公司)；KS12型离心机(美国Thermo Scientific公司)。

1.2 试药睡莲酚(新疆维吾尔自治区药物研究所药物合成室自制，纯度>98.0%)；RPMI-1640培养基(美国hyclone公司，批号AD16152253)；PBS缓冲溶液(美国hyclone公司,批号AD15805314)；胎牛血清FBS (以色列BI公司, 批号1805172)；胰蛋白酶(美国hyclone公司，批号J170048)；双抗溶液(美国hyclone公司，批号J170049)；四甲基偶氮唑蓝试剂(MTT，北京酷来搏科技有限公司,批号CM28152114)；二甲基亚砜 (DMSO，上海百研生物科技有限公司，批号WXBC5269V)；天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒(AST，南京建成生物工程研究所，批号20190110) ；谷氨酸氨基转移酶检测试剂盒(ALT，南京建成生物工程研究所，批号20190109)；丙二醛检测试剂盒(MDA，南京建成生物工程研究所，批号20190111)；一氧化氮检测试剂盒(NO，南京建成生物工程研究所，批号20190108)；氧化物歧化酶检测试剂盒( SOD，南京建成生物工程研究所，批号20190408)；总蛋白定量(BCA法)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20190408)；过氧化氢(北京益利精细化学品有限公司)，试剂均为分析纯。

1.3 LO2细胞人体正常肝 (LO2) 细胞由新疆医科大学中心试验室所提供，经本实验室传代后液氮保存。

2 方法

2.1 LO2细胞的培养和传代将LO2细胞放入25 cm2细胞培养瓶，加入含有10%FBS与1% 双抗的RPMI-1640培养液约4～5 mL，在5%CO2，37℃的恒温培养箱中培养，24 h后换液。观察LO2细胞的生长状态，当细胞生长融合度达到80%时用0.25%胰蛋白酶消化，1∶2传代培养，每2～3 d传代 1次即可。

2.2 LO2细胞计数方法待细胞贴壁生长并其融合度达90%时，弃去培养液，用1 mL消化液(0.25%胰蛋白酶)消化贴壁的细胞，吹打制成均匀的细胞混悬液，吸取10 μL的细胞混悬液注入到盖玻片边缘，使其充满盖玻片和计数板之间。在显微镜下统计4个方格中的细胞数目(只计左侧和上方的压线细胞，不计右侧和下方；如细胞密度太高，可稀释后计数)，求平均值。细胞数目计算公式：细胞数目/mL=4个方格细胞总数目/4×104。

2.3 LO2细胞毒性实验(MTT法)方法取对数生长期的LO2细胞，用1 mL消化液(0.25%胰蛋白酶)消化细胞，加完全培养液终止消化，离心，将收集的细胞中加入培养液稀释成密度为5×104个/mL的细胞混悬液，吹匀，按每孔100 μL体积接种到96孔细胞培养板。在37℃，5%CO2的培养箱中培养24 h。弃去上清培养液后每孔给药100 μL，给药组分别加入应浓度为6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/mL的睡莲酚溶液100 μL，空白组加入100 μL完全培养液，阴性对照组加入100 μL培养基，每组设6个平行孔。药物作用24、48、72 h后，每孔加入5.0 mg/mL的MTT 10 μL，在原条件下继续培养4 h，吸取上清液，每孔加入DMSO 100 μL，震荡使结晶完全溶解，用酶标仪测定490 nm处OD值(实验重复进行3次)。按如下公式计算细胞存活率：细胞存活率=(实验组OD值-阴性对照组OD值)/(空白组OD值-阴性对照组OD值)×100%。

2.4 H2O2致LO2细胞损伤模型的建立取对数生长期的LO2细胞，加入1 mL消化液消化细胞，调成细胞密度为5×104个/mL的LO2细胞混悬液，每孔200 μL接种于96孔板，培养24 h，待细胞贴壁生长后弃去上清液，对照组每孔分别给予浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L 的H2O2溶液200 μL，空白组给予200 μL完全培养液，每个浓度设6个平行孔，继续在培养箱中培养2、4、8、12、24 h后加入2.5 mg/mL 的20 μL MTT溶液，培养4 h后弃去上清液，避光加入150 μL 的DMSO，用酶标仪测定490 nm处OD值，按“2.3”项下公式计算细胞存活率。

2.5 睡莲酚对H2O2致LO2细胞损伤的保护作用将对数生长期的LO2细胞用1 mL消化液消化，计数后配成5×104个/mL 细胞混悬液，接种于96孔板200 μL/孔，在37℃，5%CO2的培养箱中培养24 h后待细胞贴壁生长，弃去上清液。给药组给予各浓度分别为0、6.5、12.5、25.0 μg/mL的睡莲酚200 μL/孔，阴性对照组加入200 μL培养基(没有细胞)，对照组和空白组加入200 μL完全培养液，每组设6个平行孔，置37℃，5%CO2的培养箱中培养24 h后，对照组和给药组加入H2O2溶液200 μL/孔(H2O2的终浓度为0.6 mmol/L)，空白组每孔加200 μL完全培养液，培养4 h后每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，混匀，在原条件下继续孵育4 h后终止培养，弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO使结晶充分溶解均匀，用酶标仪测定490 nm处OD值，按“2.3”项下公式计算细胞存活率，每组实验重复3次。

2.6 LO2细胞上清液ALT、AST、MDA、SOD及NO水平测定按同“2.5”项下分组及给药，取LO2细胞，消化、收集、计数后调成5×104个/mL 细胞混悬液，2.0 mL/孔接种于6孔板，培养24 h，待细胞贴壁生长后弃去上清液。给药组给予各浓度分别为0、6.5、12.5、25.0 μg/mL的睡莲酚2.0 mL/孔，对照组和空白组加入2.0 mL完全培养液，于37℃、5%CO2的培养箱中培养24 h，对照组和给药组给予体积为2 mL/孔的H2O2溶液(H2O2的终浓度为0.6 mmol/L)，空白组加完全培养液2.0 mL，每组设6个复孔，继续恒温培养4 h后，观察细胞生长状态，参照试剂盒说明书操作检测ALT、 AST、MDA、SOD及NO水平，每组实验重复3次。

2.7 LO2细胞的形态观察取对数生长期的LO2细胞，用1 mL消化液(0.25%胰蛋白酶)消化细胞，加完全培养液终止消化，离心，将收集的细胞中加入培养液稀释成密度为5×104个/mL的细胞混悬液，吹匀，按每孔2 mL体积接种到6孔细胞培养板。在37℃，5%CO2的培养箱中培养24 h。弃去上清培养液后每孔给药2 mL，给药组加入100 μL含相应浓度为6.25、12.50、25.00 μg/mL的睡莲酚，对照组和空白组加入2 mL完全培养液，于37℃、5%CO2的培养箱中培养24 h后，给药组和对照组加入0.6 mmol/L的 H2O2，空白组加完全培养液2.0 mL，继续培养4 h后，在倒置相差显微镜下(×100)观察细胞的生长状况及形态。

3 结果

3.1 LO2细胞毒性实验结果与空白组比较，给药组对LO2作用24、48、72 h后，在6.25～25.00 μg/mL浓度范围内LO2的细胞活力正常,对细胞的增殖和毒性无明显影响，差异无统计学意义(P>0.05)，确定睡莲酚的安全给药浓度范围为6.25～25.00 μg/mL，见表1。

表1 睡莲酚对LO2细胞活力的影响

注： 与空白组比较，*P<0.01。

3.2 H2O2致LO2细胞损伤模型的建立结果与空白组比较，对照组H2O2在0.4～1.2 mmol/L浓度范围内对LO2细胞均造成损伤，差异有统计学差异(P<0.05)，本研究选择0.6 mmol/L H2O2处理LO2细胞4 h建立H2O2损伤LO2细胞模型，见表2。

表2 不同浓度H2O2处理LO2不同时间的损伤

注：与空白组比较，*P<0.05。

3.3 睡莲酚对H2O2致LO2细胞损伤的保护作用与空白组比较，对照组LO2细胞存活率降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，不同浓度给药组LO2细胞存活率降低，差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

3.4 LO2细胞的形态观察与对照组比较，空白组细胞生长状态良好，细胞边界清楚，其大小均匀，细胞间连接紧密，贴壁牢固；对照组细胞数量减少，细胞边界不清，有细胞脱落，甚至损伤破裂；给药组细胞数量和形态均有明显改善，接近于正常组，见图2。

表3 睡莲酚对H2O2致LO2细胞损伤的存活率

注：与空白组比较，#P<0.05； 与对照组比较，*P<0.05。

A: 空白组

B: 对照组

C: 睡莲酚(6.25 μg/mL)

D: 睡莲酚(12.50 μg/mL)

E: 睡莲酚(25.00 μg/mL)

图2 睡莲酚对H2O2致LO2细胞损伤的影响(×100)

3.5 睡莲酚对H2O2损伤LO2细胞上清液AST、ALT水平的影响与空白组比较，对照组LO2细胞上清液中AST和ALT水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较，不同浓度给药组LO2细胞上清液中AST和ALT水平均降低，差异有统计学意义(P<0.01),见表4。

3.6 睡莲酚对H2O2损伤LO2细胞上清液MDA、SOD和NO水平的影响与空白组比较，对照组LO2细胞上清液中MDA和NO水平升高，SOD水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，不同浓度给药组LO2细胞上清液中MDA和NO水平降低，SOD水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表4 睡莲酚对H2O2损伤LO2细胞AST、ALT水平的影响

注：与空白组比较，#P<0.01,；与对照组比较，*P<0.01。

表5 睡莲酚对H2O2损伤LO2细胞MDA、SOD和NO水平的影响

注：与空白组比较，#P<0.05；与对照组比较，*P<0.05。

4 讨论

本研究以LO2肝细胞为研究对象，研究睡莲酚对正常细胞及损伤细胞增殖、形态以及相关生化指标的影响。体外肝毒性通常表现在LO2细胞活力下降[9-10]、细胞形态受损[11]、细胞膜受损通透性等[12]。参照相关研究建立H2O2损伤 LO2细胞模型[11-13]，H2O2通过改变LO2细胞的形态和结构，造成肝细胞的氧化性损伤，破坏LO2细胞的细胞膜和细胞结构，提高肝功能相关酶AST、ALT水平及脂质过氧化产物MDA和NO水平，导致SOD抗氧化酶活性降低，进一步加重肝细胞的损伤，和文献报道的数据基本一致[14-19]。睡莲酚作用后，细胞形态和结构得到改善，细胞代偿性增殖减少，细胞中ALT、AST水平降低， SOD活性升高， MDA和NO的含量减少，减轻了氧化产物对LO2细胞的损害。综上所述，睡莲酚通过提高抗氧化功能，降低细胞膜脂质过氧化发挥对肝细胞损伤的保护作用。睡莲酚对体外培养LO2细胞无明显损伤影响，为睡莲酚的后续安全应用提供了理论依据。