山茱萸新苷Ⅰ对成骨细胞的增殖及成骨分化的影响

黄佳纯 林燕平 陈桐莹 柴爽 黄宏兴

1. 广州中医药大学，广东 广州 510006 2. 广州中医药大学岭南医学研究中心，广东 广州 510240 3. 广州中医药大学附属第三医院，广东 广州 510240

骨质疏松症(osteoporosis，OP)主要是由骨质量和骨密度下降引起的，是一种全身性代谢性骨病变，骨微结构失衡导致的骨脆性增加，很容易导致骨折的发生。其中，成骨细胞是促进骨形成的主要功能细胞，是骨质疏松发生中起关键作用的细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。成骨细胞的增殖和成骨分化在骨量丢失中起着抑制作用[1]，因此，探究如何促进成骨细胞增殖分化对预防和治疗骨质疏松症具有重要意义。山茱萸具有补益肝肾的功效，临床上可作为治疗骨质疏松中药配方的组成药物之一，是传统医学应用广泛的药物[2]。山茱萸新苷Ⅰ是从山茱萸提取出来的一种环烯醚萜苷，属于山茱萸的有效成分。多研究[3-4]表明，内质网应激对于成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞的生长起着重要作用。基于此，本研究主要研究山茱萸的有效成分山茱萸新苷Ⅰ对成骨细胞的增殖分化及相关内质网应激通路的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要仪器：超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；细胞培养箱、离心机(美国Thermo Fisher公司)；实时荧光定量聚合酶链式反应扩增仪(CFX96TM)；Mini-protean tetra小型垂直电泳仪/转膜仪(美国Bio-Rad公司)；凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；倒置荧光显微镜(美国OLYMPUS公司)。

1.1.2动物与药物：出生24 h SD大鼠购自广州中医药大学实验动物中心，SPF级，质量不限，性别不限。山茱萸新苷Ⅰ(山茱萸新甙Ⅰ，cornuside Ⅰ)购自成都曼思特生物科技有限公司，提取来源为山茱萸科山茱萸属植物山茱萸的干燥果实，分子式为C30H50O20，分子量542.49，为类白色晶体，可溶于DMSO、甲醇，纯度≥98%，20 mg/支。

1.1.3材料与试剂：alpha-MEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)，胰酶(美国sigma公司)，Western blot试剂盒、ALP染色试剂盒(上海碧云天)，PCR试剂盒(BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1大鼠原代成骨细胞的提取与培养：成骨细胞的提取：乳鼠2只，脱臼处死后在75%酒精中10 min充分浸泡消毒备用，超净台内取出头盖骨，预冷的PBS缓冲液冲洗3次以去除脂肪组织及残留血，将颅骨剪成1 mm×1 mm的骨碎片，移入15 mL离心管内，加入1 mL 0.25%胰酶，37 ℃预消化20 min后加入完全培养基3 mL终止消化，1 000 r/min离心5 min后弃上清，再加入0.1%的Ⅱ型胶原酶1 mL，37 ℃中消化1 h后1 000 r/min离心10 min，弃上清液，PBS洗涤2次，每次都1 000 r/min离心5 min，弃上清液，最后一次弃上清后加入完全培养基，吹打均匀后200目滤网除去骨碎片，滤液于培养皿中培养，37 ℃，5%CO2孵箱中孵育5 min，更换培养皿，重复2次。每隔48 h换液1次。

1.2.2成骨细胞的鉴定：活细胞形态观察：每天镜下观察细胞形态变化及生长状况并进行拍照。碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107/L，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL，以后每3天换液。待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，体积分数95%乙醇固定30 min，按碱性磷酸酶染色试剂盒要求进行。主要观察成骨细胞的形态、特征性染色。

1.2.3CKK8：收集P4细胞，制成100个/μL的细胞混悬液，加到96孔板。37 ℃，5%CO2孵育过夜。隔日换液，加入相应浓度梯度(0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mmol/mL)含山茱萸新苷Ⅰ的培养基和完全培养基(空白对照组)，每组设5个复孔，37 ℃，5%CO2中培养。干预的第1、3、5、7 天进行检测：每孔加入10 μLCKK-8溶液，37 ℃孵育30 min，测定450 nm各孔的吸光值。

1.2.4ALP染色：收集P4细胞，制成100个/μL的细胞混悬液，加入24孔板中，37 ℃，5%CO2培养过夜，隔日按分组加相应浓度梯度(0.063、0.125、0.25、0.5、1 mmol/mL)含山茱萸新苷Ⅰ-成骨诱导液或成骨诱导液(空白对照组)。3 d换液1次，37 ℃，5%CO2培养7 d后，PBS洗涤3次，4%的多聚甲醛4 ℃固定30 min；PBS洗涤3次，按照试剂盒的说明配置成BCIP/NBT染色工作液；最后一次洗涤完毕后去除洗涤液，加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保样品被充分覆盖；室温避光孵育30 min，去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸馏水洗涤2次终止显色反应；去除残留液体，完成显色，拍照。

1.2.5RT-PCR检测基因表达：收集P4细胞，制成100/μL的细胞混悬液，加到6孔板中，置37 ℃，5%CO2培养过夜，隔日换液，参照CKK-8及ALP染色的实验结果加入适宜浓度的药物，设立空白组，细胞培养箱培养48 h后提取各组细胞的总RNA，测定RNA溶液的纯度后进行逆转录。检测Wnt2、β-catenin、BMP2、OPG、NOX4、PERK的mRNA表达情况。以GAPDH作为内参照，每组均做3个重复，取均数，采用双标准曲线相对定量方法对基因进行定量分析。

1.2.6Western blot检测蛋白表达：收集P4细胞，制成100个/μL的细胞混悬液，加到6孔板中，置37 ℃，5%CO2培养过夜，隔日换液，参照CKK-8及ALP染色的实验结果加入适宜浓度的药物，设立空白组，细胞培养箱培养48 h后分别提取各组细胞总蛋白，12 000 r/min离心15 min，取上清100 μL，测出蛋白浓度，配制样品，通过上样、电泳、转膜、封闭、孵育一抗二抗后显影，检测Wnt2、β-catenin、BIP、CHOP、PDI蛋白的表达情况，测出相应灰度值进行分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠原代细胞的鉴定

倒置相差显微镜下的大鼠成骨细胞充分铺展，多呈现梭形。细胞伸展，有长短不一的突起，呈集落样生长趋势，见图1。碱性磷酸酶活性检测结果可见大量染色阳性细胞出现，细胞膜及胞浆内颗粒染色呈蓝黑色颗粒，块状深染颗粒，见图2。

图1 倒置相差显微镜下的大鼠成骨细胞Fig.1 The rat osteoblasts under the inverted phase contrast microscope

图2 碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色Fig.2 Alkaline phosphatase activity assay for cytochemical staining

2.2 山茱萸新苷Ⅰ对成骨细胞的增殖影响

不同浓度山茱萸新苷Ⅰ干预下，成骨细胞出现不同程度的增殖，多在第1～5天时表现1个逐渐上升的趋势，而在第5天之后增殖速率随即下降；其中当药物浓度为1 mmol/mL、干预时间为5 d时，OD值最高(图3)。ALP染色显示出药物干预后的成骨细胞的颜色明显深于未加药的一组，即加药组细胞成骨分化程度优于空白对照组(图4)。

图3 CKK8检测不同浓度山茱萸新苷Ⅰ干预下细胞的增殖Fig.3 CKK8 test for the proliferation of osteoblasts intervened by different concentration of cornuside I

图4 ALP染色检测不同浓度山茱萸新苷Ⅰ干预下细胞的成骨分化Fig.4 ALP staining for detection of osteogenic differentiation of osteoblasts intervened by different concentration of cornuside I

2.3 山茱萸新苷Ⅰ对成骨细胞基因表达的影响

与空白对照组相比，山茱萸新苷Ⅰ组的成骨细胞Wnt、BMP2、OPG和NOX4的mRNA表达水平显著升高(P<0.01)，β-catenin升高幅度不大，但差异具有统计学意义(P<0.01)，而PERK的mRNA表达水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)(图5)。

图5 山茱萸新苷Ⅰ对成骨细胞基因表达的影响Fig.5 The effect of cornuside I on mRNA expression of osteoblasts

2.4 山茱萸新苷Ⅰ对成骨细胞蛋白表达的影响

与空白对照组相比，山茱萸新苷Ⅰ组的成骨细胞Wnt、β-catenin、PDI蛋白表达量显著升高(P<0.01)，CHOP表达亦有轻微上升，但不明显(P>0.05)。而BIP的蛋白表达水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)(图6，表1)。

表1 山茱萸新苷Ⅰ对成骨细胞蛋白相对表达量的影响Table 1 The effect of cornuside I on protein expressions in osteoblasts

注：与对照组相比，①P<0.01，②P<0.05，③P>0.05。

图6 成骨细胞中(Wnt、β-cantenin、BIP、CHOP、PDI)蛋白表达Fig.6 The protein expressions of Wnt, β-cantenin, BIP, CHOP, and PDI in osteoblasts

3 讨论

OP是一种全身代谢性骨病，主要以骨量减少和骨微结构退化为特征，它引起最严重的并发症是骨脆性增加带来不断上升的骨折风险[5]。相关调查表明，目前骨质疏松症已经是世界五大疾病之一[6]，据统计，如今全世界患骨质疏松症的已远远超过2亿人数，估计在2020年，我国骨质疏松症患者将占全世界骨患者人数的一半以上，增加到3亿人，还有研究表明，在2050年估计用于骨质疏松性骨折的医疗费用将达到1 630亿元[7]，故对骨质疏松症的防治是刻不容缓的。

山茱萸是补益肝肾的传统中药，研究表明[8]，山茱萸总甙能对调节去势大鼠骨组织的TRPV6、TRPV5蛋白表达起作用，其通过改变TRPV6/TRPV5的比值来影响成骨细胞和破骨细胞功能，有促成骨和提高骨密度的功效。山茱萸苷能提高大鼠皮层神经细胞存活率、线粒体的抗氧化酶活性、呼吸酶活性和呼吸控制率及ATP含量，减少线粒体丙二醛的产生，这跟细胞内Ca2+水平的升高和Caspase-3活性受到抑制相关[9]。

内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)与骨发育关系紧密，Hamamura等[10]的实验证明，持续的ERS会促使成骨细胞发生调亡，反之，短促而弱的ERS可显著提升骨分化因子如Runx2等的表达。动物实验[11]证明，苯基丁酸对成骨细胞分化、矿化能力和骨形成起到一定的作用，这是通过减弱成骨细胞中的内质网应激起作用的。阿仑膦酸钠是临床上治疗骨质疏松症的一线用药，研究发现[12]其能通过介导内质网应激来促进前破骨细胞的凋亡。内质网应激是线粒体应激发生的始动环节，线粒体在人衰老、癌症的细胞凋亡、信号转导中起着重要的作用，在细胞中充当着生命活动控制中心的角色，近年来的研究表明线粒体与骨质疏松症的发生关系密切[13]。重链结合蛋白(heavy-chain binding protein，BIP/GRP78)是一种分子伴侣，它能引导新生蛋白进入内质网帮助蛋白质正确装配。蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)一方面可以促进蛋白内或蛋白间形成正确的二硫键，另一方面也可以催化某些蛋白的二硫键的形成。Hino等[14]发现骨质疏松患者体内功能不活跃的成骨细胞，其PDI的表达显著低于健康人体内功能活跃的成骨细胞。C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)是转录因子C/EBP的同源蛋白，研究发现，内质网应激发生时，CHOP的表达水平上调，并且CHOP可介导程序性的细胞死亡即细胞凋亡。NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)是一种人体内由NOX4基因编码的酶，属NADPH氧化酶NOX家族，研究表明NOX4受PDI所调节[15]，PERK是位于内质网膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，与GRP78/BiP解离后可以促进真核细胞蛋白质翻译起始复合体2α磷酸化，该复合体位于内质网外侧，有抑制大多数 mRNA 的翻译并降低蛋白质合成速率的作用，这样可以大大减轻内质网负荷，对内质网稳态的恢复有着极大裨益。

在本研究中，山茱萸新苷Ⅰ干预下，成骨细胞的增殖得到明显的促进，成骨细胞的Wnt2、β-catenin mRNA及蛋白的表达、成骨相关基因OPG、BMP2相比对照组都呈现出上升趋势，说明山茱萸新苷Ⅰ在Wnt/β-catenin信号通路上起促进作用。GRP78/BIP和PDI的蛋白表达量相对于空白对照组是明显上升的，而CHOP的蛋白表达量并没有发生太大的差异，有趣的是，PERK的基因表达是下降的，与前人所得出的结果有所矛盾，说明在内质网应激的层面上还有很多需要深入探究的地方。

综上所述，山茱萸新苷Ⅰ确实促进成骨细胞的增殖及成骨分化，该中药单体可正向调节成骨细胞内的Wnt/β-catenin信号通路，促进分子伴侣的表达，提高内质网正确折叠蛋白的速率，具有双向调节ERS的潜能。本研究通过从内质网应激的角度上探讨山茱萸有效成分之一山茱萸新苷Ⅰ促进成骨细胞的增殖分化的作用机理，在一定程度上丰富了补肾中药山茱萸在防治骨质疏松症上的理论知识。