维生素D与强直性脊柱炎患者甲襞微循环形态的相关性研究

张磊 高照猛 于春艳 邓尧 姜璐

胜利油田中心医院风湿免疫科，山东 东营 257034

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种慢性炎性、全身性的疾病，不仅可以累及骨关节系统，造成骨关节的强直，在疾病早期就可以出现骨量减低或者骨质疏松[1]。同时，AS还可以累及血管系统，参与动脉粥样硬化的发生，并促进高血压等疾病的致病作用。研究发现[2]，AS患者冠心病的发病率较普通人群增加30%～50%。AS异常骨代谢与血管并发症间的联系尚不明确，这其中维生素D可能发挥了重要作用。维生素D除了钙调节作用外，还能调节免疫细胞，抑制树突状细胞和T淋巴细胞的生长、分化，抑制白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)等参与AS的发病[3]，并通过多种途径参与了心血管疾病的发生[4]。在AS慢性炎症状态下，多种炎症因子损伤血管内皮，不仅使冠状动脉微血管损伤，也可致全身微循环功能障碍[5]，并可通过皮肤微循环状态反映出来[6]。目前国内外尚无关于AS维生素D水平与微循环状态的研究，所以笔者开展了相关临床研究工作，旨在探讨维生素D对微循环的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2016年5月至2018年10月在胜利油田中心医院(以下简称“我院”)风湿免疫科就诊的AS患者121例，均符合1984年修订的纽约AS分类标准[7]，其中男性113例，女性8例，年龄18～59岁，平均(38±10)岁。所有患者均接受一种非甾体抗炎药及柳氮磺吡啶、甲氨蝶呤或来氟米特治疗。所有患者详细记录HLA-B27、CRP、ESR等实验室项目。排除标准：合并发热性疾病；高血压；糖尿病；严重肝肾、心脏等功能不全；其他慢性或急性炎症性疾病；肿瘤性疾病；3个月内接受过维生素D制剂治疗；12个月内接受过抗TNF-α生物制剂治疗。对照组80名均来自我院健康查体中心，无关节炎病史，且年龄、性别匹配。本研究经我院伦理委员会审查通过，所有受试者均签署书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1病情活动度计算：依据相关研究[8]，通过下述公式计算患者病情活动度评分：Q1～Q6分别代表巴氏强直性脊柱炎活动指数 (bath ankylosing spondylitis disease activity index，BASDAI)中第1～6题的视觉模拟评分(visual analogue scale，VAS；0～10 cm)。ASDAS-CRP=0.12×Q2+0.06×Q6+0.11×患者对病情评价(VAS)+0.07×Q3+0.58×In(CRP+1)。依据冀肖健等[9]研究，若检查CRP小于3.5 mg/L时取1.5 mg/L计算ASDAS-CRP。

1.2.2甲襞微循环检测方法：运用江苏同人医疗电子科技有限公司TR8000D型微循环检测仪(编号TR1580D10001，微循环检测镜为SONY公司TR15SXJG001)，检查取患者左手环指，并放置于心脏水平位置，滴松节油0.2 mL到待检指甲襞处，需要时用玻璃棒涂抹均匀。用可视甲襞微循环检测镜直接观察甲襞微循环，避免按压甲床，由1名经验丰富的检测员截取图像并测量有关数据，最后由计算机内置程序计算加权积分并出具报告。所有受检患者于检查6 h前禁止服用含咖啡因饮料及吸烟，检查前于室温20 ℃～25 ℃检查室内休息15～20 min。

1.2.3甲襞微循环有关参数定义：毛细血管密度定义为测量指末梢端1 mm范围内的毛细血管数量。毛细血管长度定义为毛细血管袢弯曲顶端到基底区间的距离，动静脉支最宽处的距离分别定义为动脉支宽度和静脉支宽度。毛细血管袢直径或袢顶径定义为毛细血管袢顶端最宽距离。测量方法可参考图1。

图1 正常毛细血管相关参数测量Fig.1 Measurement of normal capillary parameters

1.2.4相关实验室检查方法：抽取受试者空腹静脉血3 mL左右，留取血清并于-80 ℃冻存。魏氏法检测 ESR，免疫散射速率比浊法检测 CRP(参考范围：0～6 mg/L)。血清25(OH)D3采用罗氏诊断公司光化学免疫分析法试剂盒检测。按照25(OH)D3水平分组[10]：25(OH)D3<10 ng/mL为严重缺乏组；10 ng/mL≤25(OH)D3<20 ng/mL为缺乏组；20 ng/mL≤25(OH)D3<30 ng/mL为不足组；30 ng/mL≤25(OH)D3<50 ng/mL为充足组。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 AS患者与健康人群指标的比较

本研究中无VitD充足者，AS患者血清25(OH)D3水平[(18.73±5.99) ng/mL]低于健康对照人群[(22.53±5.56) ng/mL]，差异具有统计学意义(t=-3.883，P<0.01)。AS患者甲襞微循环积分(5.49±2.29)显著高于对照组(1.34±0.57)，差异具有统计学意义(t=13.616，P<0.01)。见表1。

表1 AS组和健康对照组人群一般情况Tabel 1 Characteristics of the patients with AS and healthy control subjects

2.2 AS患者不同血清25(OH)D3水平组间的一般情况比较

AS患者依据血清25(OH)D3水平分为VitD不足亚组[(24.32±3.03) ng/mL]和VitD缺乏亚组[(14.23±3.49) ng/mL]。两亚组间比较，年龄、性别、病程、HLA-B27等无显著差异，VitD不足亚组的血沉、CRP、ASDAS-CRP积分低于VitD缺乏亚组，差异具有统计学意义(r=-2.064、-2.163、-5.441；P=0.024、0.035、0.000)。VitD不足亚组的甲襞微循环积分(3.82±1.44)低于VitD缺乏亚组(6.68±2.03)，差异具有统计学意义(r=-6.393，P=0.000)，见表2。

表2 AS患者按25(OH)D3水平分组后的临床资料比较Table 2 Comparison of clinical data among AS subgroups based on 25(OH)D3

2.3 AS患者不同25(OH)D3水平组间甲襞微循环形态学比较

VitD缺乏组的毛细血管密度、动静脉支管径分别小于VitD不足组和对照组(P均<0.01)，管袢直径分别大于VitD不足组和对照组(P均<0.01)；VitD不足组的毛细血管密度、动静脉支直径均小于对照组(P均<0.01)，管袢直径大于对照组(P=0.001)，毛细血管长度与对照组相比无显著差异(P=0.832)，详见表3。

2.4 25(OH)D3水平与甲襞微循环积分的相关性分析

Pearson相关分析显示，25(OH)D3水平与甲襞微循环积分呈负相关(r=-0.637，P<0.01)，控制年龄、病程、血沉、CRP、ASDAS-CRP等变量后，调整后的相关系数为r=-0.357，P<0.01，见图2。进一步多元线性回归分析提示25(OH)D3水平下降是甲襞微循环积分增高的风险因素(β=-0.099，P=0.001)，见表4。

表3 各亚组间甲襞微循环血管形态分析Table 3 Comparison of nailfold capillaroscopic morphology of AS subgroups

图2 血清25(OH)D3与甲襞微循环积分的相关分析Fig.2 Regression analysis between 25(OH)D3 and nailfold capillary scores

表4AS患者甲襞微循环积分相关因素的多元线性回归

Table4Multiple linear regression analysis of the associated factors of nailfold capillary scores in patients with AS

变量β95%CISEt值P值25(OH)D3-0.099-0.157,-0.040-0.259-3.3890.001CRP0.0290.002,0.0570.1502.1340.002ASDAS-CRP1.1250.729,1.5200.5685.6990.000

3 讨论

AS是一种慢性全身性的炎性疾病，与HLA-B27密切相关，主要累及骶髂关节等中轴关节。研究发现[1]，在疾病的早期阶段，AS患者就可以出现骨量减少或骨质疏松，这一比例甚至高达62%，但是详细机制尚未被完全阐明，这其中维生素D发挥了重要作用。研究发现[11]，活性维生素D与靶器官组织细胞核上的维生素D受体结合后发挥作用，除调节钙代谢外，还可以抑制IL-6、TNF-a等炎症因子，下调破骨细胞的活性，参与AS的发病机制和骨代谢。维生素D在血液中主要以25(OH)D3的形式运输，其半衰期为14 d左右，故检测血清25(OH)D3的浓度是评价体内维生素D的重要方法。此次研究发现AS患者25(OH)D3水平为(18.73±5.99)ng/mL，显著低于健康人群，与国内外研究结果一致[12-13]。本研究同时发现VitD不足组患者的血沉、CRP、ASDAS-CRP积分均低于VitD缺乏亚组(r=-2.064、-2.163、-5.441；P=0.024、0.035、0.000)，提示25(OH)D3水平越低，疾病活动度越高，与Cai等[14]的荟萃分析结果一致。

维生素D通过抑制前列腺素和环氧合酶途径、细胞因子诱导的粘附分子表达减少、基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinase，MMP)9的减少等[15]抑制炎症反应。在AS慢性炎症状态下，低水平的25(OH)D3进一步加剧炎症进展，促使血管内皮细胞损伤，促进动脉粥样硬化的发生、发展。Han等[16]所做的对照研究显示AS患者发生动脉粥样硬化的概率是正常人对照组的1.5倍，周围血管疾病发生率为1.6倍，脑血管疾病为1.7倍，高血压为1.3倍，AS已被认为是独立的心血管风险因素[17]。然而目前的研究[18]主要针对中大血管的并发症，较少关注AS的微循环状态。此次研究中，选取健康人群作为对照，校正了高血压、糖尿病等传统风险因素后发现，AS患者甲襞微循环积分(5.49±2.29)显著高于对照组(1.34±0.57)，t=13.616，P<0.01，提示AS患者存在微循环障碍，同时线性回归分析证实AS病情活动与甲襞微循环异常密切相关(β=1.125，P<0.01)。

研究[19]证实低水平的25(OH)D3加重了血管内皮细胞的炎症负担，加剧了AS患者动脉粥样硬化的发生，是否也会造成AS微循环障碍的发生也是本研究关注的重点。在校正ASDAS-CRP等因素后，本研究发现低水平的25(OH)D3是甲襞微循环积分增高的风险因素，与AS患者甲襞微循环积分呈显著负相关(r=-0.357，P<0.01)。依据既往的研究[20-21]，维生素D缺乏会导致一氧化氮对血管内皮的保护作用减弱，导致细胞质内游离钙降低，减少平滑肌细胞产生前列腺素，促进血管内皮细胞收缩，进而影响循环状态。同时，维生素D还可通调节IL-17等细胞因子影响血管功能。IL-17是一种急性炎症因子，由活化后的Th7细胞分泌，促进成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞中的MMP产生MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13，加重动脉内膜炎症反应，促进动脉粥样硬化和循环障碍的发生[22]。IL-17还可通过诱导血小板聚集和内皮细胞迁移、增殖而促进血栓形成[23]。Shen等[24]研究发现，AS和RA患者外周血单核细胞中IL-17阳性CD4+T细胞数量高于健康对照人群，而AS患者血清IL-17聚集程度比RA更为明显，提示IL-17介导了AS更为严重的炎症反应。此次研究限于目前研究条件未能开展维生素D、甲襞微循环与IL-17等炎症因子的相关性研究，但为将来的基础研究提供了思路。

AS等炎症性疾病被证实皮肤血管功能受损[25]。皮肤中大部分地区的毛细血管袢中垂直于皮肤表面，而在甲襞区域则平行于皮肤表面，这允许通过甲襞微循环镜可以检测到其整个毛细血管长度等形态学特征。甲襞微循环镜是一种高度敏感的且安全、无创性影像学技术，用于检测甲襞区域微循环状态，并已被证明在某些风湿性疾病的鉴别诊断中有帮助[26]。Batko等[27]研究发现20.4%的AS有甲襞微循环形态异常，表现为管袢增粗、毛细血管卷曲、分支增多、毛细血管周围水肿等，并且经过抗TNF-a制剂治疗后可改善毛细血管周围水肿，但对其他形态学变化无影响。本研究在排除了接受TNF-a抑制剂治疗的患者后发现，AS同样存在着显著的甲襞微循环形态异常，表现为毛细血管密度下降、毛细血管动静脉支变细、管袢增粗等，VitD缺乏组的毛细血管密度、动静脉支管径分别小于VitD不足组和对照组(P均<0.01)，管袢直径分别大于VitD不足组和对照组(P均<0.01)，提示25(OH)D3水平越低，形态学异常越显著，但是这些形态学变化对早期诊断、病情预后是否具有特异性，仍需未来严格设计的前瞻性研究证实。

本研究同样存在一定局限性，如检查者的经验、方法等差异会对微循环的量化产生影响；受试者的紧张情绪以及随着患者年龄的增长、器官组织的老化、毛细血管前因素如动脉硬化等及血流的管内因素如血液黏度、血脂、血管周围结缔组织的变化等也会对微循环产生影响。另外，如果研究未对微循环血流等动态变化及功能做出评估，甲襞微循环镜检查只能看到毛细血管，部分能看到毛细血管丛，不能观察到细动脉、细静脉，对局部整体循环判断有局限性；非甾体抗炎药[28]及甲氨蝶呤等[29]慢性抗风湿药物也可能会减少血管内皮细胞增殖或抑制血管形成，影响微循环功能。

总之，AS患者存在不同程度的维生素D缺乏，血清25(OH)D3水平下降与甲襞微循环积分升高显著相关，是AS患者发生微循环障碍的危险因素，详细机制仍需进一步研究。