补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖对大鼠膝软骨细胞增殖及凋亡影响的研究

李宇 王伟 邱裕佳

1.葫芦岛市中心医院，辽宁 葫芦岛 125000 2.锦州医科大学骨外科学研究所，辽宁 锦州 121000 3.辽宁省医学组织工程重点实验室，辽宁 锦州 121000 4.锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)又称骨质增生性关节炎、退行性关节炎等，是一种进行性慢性发展的骨关节疾病[1]，以膝关节发病为多见，关节软骨受损是此疾病的重中之重，而软骨细胞的增殖与凋亡对受损软骨的修复起着至关重要的作用。骨性关节炎导致关节疼痛，有时伴有关节畸形，功能受限，此病已严重影响了中老年人的正常生活，给社会及家庭带来严重的经济负担[2]。

中医学中认为，此疾属于“骨痹”“筋痹”等范畴，所谓骨痹主要分为风寒湿症、肝肾亏虚、湿热蕴结、痰湿血瘀、当风寒湿邪入体，阴阳及脏腑失衡，血行不畅而瘀阻，加之肝肾之气不足，而致筋骨不利。补肾壮筋汤首载于清·钱秀昌所著的《伤科补要》，此方具有补益肝肾、强筋壮骨、活血化瘀的功效，应用于膝OA的治疗中效果显著[3]。

盐酸氨基葡萄糖(glucosamine sulfate，GS)在软骨基质中分布较广泛，属于一种小分子化合物，不仅能够有效促进软骨蛋白聚糖的生成，而且也能有效控制炎细胞和介质的扩散[4]，降低软骨细胞内毒性，临床应用中已成为0到II级膝骨性关节炎的常规用药，其治疗效果在临床上已得到公认[5]。

本实验选用了中医经典方剂补肾壮筋汤与盐酸氨基葡萄糖联合应用，制备含药血清，对大鼠膝软骨细胞的增殖、凋亡及II型胶原蛋白表达方面进行检测，为膝骨性关节炎的中西医结合治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物：本研究选用未交配的SPF级大鼠32只，雌雄不拘，体重为(200±20) g(锦州医科大学实验动物中心，实验动物质量合格证明号：211001200000172)，进行适应性饲养3 d，并随机分为单纯血清组(生理盐水)、中药血清组(补肾壮筋汤)、西药血清组(盐酸氨基葡萄糖)、中西结合血清组(补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖)4组，每组8只。

1.1.2实验药物与制备：按照大鼠每日用药量为人每千克每日用药量的6.3倍，按大鼠胃容量为容积为每100 g 0.875 mL灌胃给药。

补肾壮筋汤灌胃汤剂制备：熟地黄0.012 mg，当归0.012 mg，牛膝0.010 mg，山茱萸0.012 mg，茯苓0.012 mg，续断0.012 mg，杜仲0.010 mg，白芍0.010 mg，青皮0.005 mg，五加皮0.010 mg，以上药物均采购于辽宁中医药大学附属医院。水煎浓缩，用蒸馏水调节药物浓度至100%，制成每毫升含生药1 g。根据动物与人体每千克体重剂量折算公式计算每只大鼠的给药剂量为7.52 mg/g。

盐酸氨基葡萄糖(北京葡立药业有限公司，批号：H20173212)灌胃剂制备：大鼠每日灌胃剂量为0.375 mg。

正常对照组灌胃剂制备：用等量0.9%氯化钠注射液(华仁药业股份有限公司，批号：H20023145)。

1.1.3主要试剂：硝普钠(购自Sigma公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(购自DoJinDO公司)，MTT(购自索莱宝公司)，胎牛血清(购自SeraPro公司)，青链霉素、胰蛋白酶、DMEM培养液、购自HyClone公司)，阿尔新蓝染色试剂盒(购自Sigma公司)，兔抗II型胶原蛋白多克隆抗体(购自Abcam公司)，SDS-PAGE凝胶试剂盒、蛋白提取试剂盒、定量试剂盒(均购自上海碧云天生物技术有限公司)。

1.1.4主要仪器：倒置显微镜(Olympus公司公司)；荧光显微镜(Leica公司)；紫外分光光度计(Tecan公司)；全自动电泳仪(Bio-Rad公司)；流式细胞检测仪(BD公司)；CO2细胞孵育箱(Thermo Fisher公司)；凝胶成像系统(Bio-Rad公司)。

1.2 实验方法

1.2.1大鼠软骨细胞分离培养：将大鼠断颈处死，用PBS反复冲洗剪下的大鼠膝关节软骨，制备成1 mm3的碎块，在37 ℃条件下，用胰蛋白酶(0.25%)消化30 min，再用Ⅱ型胶原蛋白酶(0.1%)消化60 min，1 000 r/min离心10 min，收集细胞。加入含胎牛血清DMEM培养液(10%)中，以合适的浓度(1×106个/mL)接种于培养皿中，在CO2细胞孵育箱培养；48 h观察细胞贴壁及生长状态，每2～3 d换液1次，当镜下观察软骨细胞汇合成片长满大部分培养皿时，加入胰蛋白酶(0.25%)进行传代养。细胞传代至第4代时，方达到本实验研究的要求，用于本实验。

1.2.2含药血清制备：各组大鼠适应性喂养3 d后，药物灌胃1周，取材前禁食水，于第8天早灌胃2 h后，先用10%水合氯醛按大鼠体重每百克0.3 mL腹腔注射进行麻醉，采用腹主动脉取血法收取血液，4 ℃低温保存4 h后，以3 000 r/min的速度离心30 min，取上清，用0.22 μm滤膜除菌分装，-80 ℃保存待用。

1.2.3软骨细胞阿尔新蓝染色：按阿尔新蓝染色试剂盒配置液体，染色方法：弃培养基，PBS漂洗3次，5 min/次，4%多聚甲醛固定30 min(室温)，PBS漂洗3次，0.1 N HCL溶液浸洗5 min时PH值降至1.0，阿尔新蓝染色过夜，0.1 N HCL漂洗3次，5 min/次，去除背景，镜下观察。

1.2.4MTT法检测细胞增殖活力：计数以5×104个/mL浓度的细胞悬液，接种于96孔培养板中。实验分组：空白对照组、单纯血清组、中药血清组、西药血清组、中西结合血清组，除空白对照组以外其余各组予以相应含0.6%、1.2%、2.4%含药血清的培养基处理。培养24 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，于CO2孵箱中继续培养4 h，弃去培养基，每孔加入200 μL DMSO。用酶联免疫检测仪在570 nm处检测各孔的吸光度值。

1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡：制备大鼠软骨细胞悬液(1×106个/mL)接种于培养皿中，在5%CO2培养箱中37 ℃预培养24 h。加入终浓度为2 mmol/L的SNP作用24 h制作软骨细胞凋亡模型。将凋亡软骨细胞分为单纯血清组、中药血清组、西药血清组、中西结合血清组，分别予以相应含1.2%含药血清的培养基处理72 h。用胰蛋白酶消化并收集细胞，PBS洗2～3次，将细胞浓度调整为1×106个/mL。参照凋亡试剂盒的步骤说明，分别加入Annexin V-FITC(5 μL)、PI(5 μL)，4 ℃避光染色15 min，上机分析。

1.2.6Western blot法检测II型胶原蛋白的表达：收集实验各组细胞，加入裂解液裂解细胞提取蛋白。将各组蛋白按照BCA法调整至相同浓度。每上样孔加入等量蛋白，10%的SDS-PAGE胶分离电泳。半干法将蛋白转至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉室温封闭1 h。加入一抗4 ℃过夜，次日，TBST洗膜，再加入二抗室温孵育1 h。加入ECL发光试剂显像，扫描条带并采集图像分析。

1.3 统计学分析

2 结果与分析

2.1 原代软骨细胞提取及阿尔新蓝染色鉴定

在倒置显微镜下观察体外分离培养大鼠的原代软骨细胞，细胞大体呈圆球形，悬浮状态，约12 h后开始贴壁，1～2 d后部分细胞贴壁伸展，呈三角形、多角形。部分细胞出现分裂相，3～5 d大部分细胞贴壁较完全，增殖分裂加快。传代至4代时，可以观察到细胞生长速度加快，细胞周边可见具有较明显折光性的细胞外基质，细胞呈片状生长，可呈明显的“铺路石”状外观。按照阿尔新蓝染色试剂盒步骤进行染色后，倒置显微镜下观察软骨细胞多呈多角形，胞质呈均质状，较疏松，大部分可见到核仁，少数也可见分裂相，细胞浆和胞膜呈蓝色，证明培养的软骨细胞合成和分泌蛋白聚糖(见图1)。

图1 软骨细胞阿尔新蓝染色 A：放大倍数×100；B：放大倍数×200。Fig.1 Alcian blue staining of chondrocytes. A: × 100; B: × 200.

2.2 MTT法检测细胞增殖活力

采用MTT法检测实验各组的OD值，以明确中药、西药及其联合治疗在不同血清浓度下，对细胞增殖活力的影响。双因素方差分析结果显示，与单纯血清组、中药血清组、西药血清组比较，中西结合血清组OD值明显增高，且差异具有统计学意义(F=15.76，P<0.01)；不同血清浓度比较，血清浓度为1.2%时对细胞活性的促进作用最为显著(F=13.69，P<0.01)；组间两两比较显示，中西结合含药血清浓度为1.2%时，细胞OD值明显高于其他各治疗组(见图2)。此结果说明中西结合含药血清组促进软骨细胞增殖明显优于单纯血清组、中药及西药组，但不随含药血清浓度的增加呈正比例递增，当中西结合含药血清浓度为1.2%时，对软骨细胞的增殖作用最为显著。

图3 流式细胞仪检测细胞凋亡Fig.3 Flow cytometry to detect apoptosis

图2 MTT法检测细胞增殖活力Fig.2 MTT assay for cell proliferation

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。结果显示，单纯血清组、中药血清组、西药血清组、中西结合血清组细胞凋亡率分别为(91.58±0.87)%、(81.68±1.09)%、(12.32±0.44)%、(1.54±0.87)%；各组间比较存在明显差异且具有统计学意义(F=119.80，P<0.01)，其中中西医结合血清组降低软骨细胞凋亡率明显低于单纯血清组、中药血清组及西药血清组。此结果说明中西医结合组能够明显降低软骨细胞的凋亡，对软骨细胞有明显的保护作用(见图3)。

2.4 Western blot检测II型胶原蛋白的表达

采用Western blot检测上述4组中II型胶原蛋白的表达水平。结果显示，各组比较均存在差异且具有统计学意义(F=407.5，P<0.01)，其中中西医结合血清组二型胶原蛋白的表达(灰度值=1.33±0.037)均明显高于中药血清组、西药血清组及单纯血清组(灰度值=0.99±0.019、1.11±0.026、0.61±0.017)。此结果说明，中西医结合血清组能够明显促进软骨细胞中II型胶原蛋白的表达(见图4)。

图4 Western blot检测II型胶原蛋白的表达Fig.4 Expression of collagen type II detected with Western blotting

3 讨论

骨性关节炎的核心是关节软骨退行性改变，伴周围骨质增生的一种慢性进行性发展的疾病[6]。软骨细胞数量的减少或大量凋亡无疑会加速疾病的进程。因此，促软骨细胞增殖[7]及降低软骨细胞凋亡率[8]，是防治以及治疗骨性关节炎的有效途径之一。

补肾壮筋汤传承于《医宗金鉴·正骨心法要旨》中的精辟，清·钱秀昌结合自己的实践经验于1808年所著《伤科补要》记载[9]，此方中各味药相辅相成，熟地黄、山茱萸为君药，具有填精益髓、肝肾同补的作用；续断、杜仲、五加皮为臣药，增进补益肝肾、强筋壮骨、祛风除湿的作用；当归补血活血，白芍敛阴和营、柔肝止痛，茯苓健脾和胃、化痰除湿，青皮行气疏肝，同为佐药；牛膝补益肝肾、强筋壮骨、活血通经，引火(血)下行，使方中诸药直达病症为使药[10]。诸药合用可以达到补益肝肾、强筋壮骨的功效。而膝关节软骨损伤在祖国医学古籍中并无明确记载，但从此疾的病因及症状等应归属于痹症、膝痹、骨痹、痿证等范畴[11]。肝主筋，肾主骨，肝肾同源，筋约束骨骼构成关节而产生运动，筋骨是由肝肾的精气和气血来充养的。当肝血不足、肾元亏虚时骨骼也会发生异常的改变，气血不足，导致经络瘀滞，不通则痛，而补肾壮筋汤不仅可以加速局部的血液循环，其强筋壮骨的功效可以使关节退变或损伤的软骨得到改善及修复，从而达到改善和防治OA病情发展的目的[12]。

既往研究中，研究者认为补肾壮筋汤能够有效抑制OA的软骨发生退行性改变，通过抑制软骨基质中的纤维变性，降低炎症细胞和蛋白多糖的含量，增加透明质酸的含量；同时也是天然产物化合物的特殊子集，因此能够提高细胞抗氧化酶的活动，避免自由基对软骨细胞的病理性损害，从而促进软骨细胞的自我增殖与修复[13]。在本实验中，中药组对软骨细胞增殖的增殖作用明显高于单纯血清组，对软骨细胞中II型胶原蛋白的表达也明显高于单纯血清组，且差异具有统计学意义(P<0.01)。

盐酸氨基葡萄糖是一种小分子氨基多糖，是软骨基质糖胺聚糖的主要构成成分，在已受损软骨的修复过程中有着极其重要的作用[14]，当关节内软骨因退变或损伤出现裂缝时，可引起肉芽组织增生，软骨基质水解破坏，蛋白多糖的含量也因此而减少[15]。氨基葡萄糖不仅能够促进关节软骨基质中胶原的合成，还具有抑制弹性蛋白酶、溶酶体酶等水解酶的释放，促进成纤维细胞、单核巨噬细胞的移动，抑制炎症因子或肉芽组织增生范围继续扩大[16]。盐酸氨基葡萄糖对蛋白多糖的合成有促进作用，蛋白多糖是细胞膜和细胞间质重要的构成成分，能够稳定二者之间的连接[17]，给软骨细胞的增长提供稳定环境，关节软骨的代谢活动增强，关节软骨结构得到改善，对关节软骨的修复和保护起着重要的作用[18]。

当骨性关节炎疾病中软骨细胞发生凋亡时[19]，SNP可产生外源性一氧化氮(nitrous oxide，NO)，NO是由于一氧化氮合酶作用于精氨酸产生的，参与机体多个系统的病理生理过程[20]。Maneiro等[21]将体外培养的软骨细胞与较高浓度的SNP溶液共培养时发现，软骨细胞发生了明显的凋亡，其机制与SNP产生NO有关[22]。在既往研究中，有研究者认为NO在最常见的cGMP途径中作用于GTP环化酶，与血红素中的亚铁离子结合，使其空间结构发生改变，催化GTP产生cGMP的含量。同时，GTP增加后也促进了影响细胞凋亡的相关基因如bcl-2、P53等蛋白的合成[23]，从而影响细胞凋亡的发生与发展[24]。在本实验中，中西结合含药血清组能够明显降低SNP(NO)诱导软骨细胞凋亡模型中软骨细胞的凋亡率，差异具有统计学意义(P<0.01)；可能与中西结合血清组能够减少NO含量，抑制软骨细胞凋亡的发生，延缓关节软骨的退行性改变，促进关节软骨修复的作用有关。

将传统经方补肾壮筋汤与现代医学药物盐酸氨基葡萄糖联合，制备大鼠含药血清通过实验研究，中西结合血清组与单纯血清组、中药血清组及西药血清组方比较对大鼠软骨细胞增殖具有明显的优势，差异具有统计学意义(P<0.01)，促进软骨细胞中II型胶原蛋白表达也明显优于其他各实验组，差异均有统计学意义(P<0.01)。说明中西结合方式具有很好的协同作用，其作用机制可能与调节细胞外基质合成有关，降解导致细胞代谢失衡的相关因素，减轻炎症因子对软骨细胞的影响，为中西医药物联合治疗骨性关节炎提供有价值的综合化治疗方案。

近年来，研究者对中医药药理作用上有了更深层次的认知和了解，从病人的整体观入手，辨证施治，中医治病重在辨证与辨病相结合，更加适用于患者本身[25-26]。补肾壮筋汤作为骨伤疾病中的经典方剂在治疗肾虚腰痛、腰椎间盘突出症、退行性骨关节炎、骨质疏松等疾病中已取得了良好的效果[27-28]。联合现代医学药物盐酸氨基葡萄糖的治疗机理，必然能够进一步提高疗效，为广大患者服务，提高患者生活、工作质量，减轻患者的疼痛，为延缓及治疗骨性关节炎提供更为有效、安全的一种治疗方式。