骨骼源性因子对肌骨“Crosstalk”作用机制的研究进展

宗博艺 李世昌 孙朋 袁子琪

华东师范大学青少年健康评价与运动干预教育部重点实验室/体育与健康学院，上海 200241

肌肉衰减症，又称“肌少症”，是指与增龄相关的全身进行性肌肉质量减少，肌强度下降或肌肉功能减退[1]；骨质疏松症是以骨量减少，骨组织微结构破坏，骨脆性增加为主要特征的全身性骨骼疾病[2]。两种疾病具有相似的病理生理学基础，针对肌肉、骨骼分子水平上的共同靶点施加干预成为治疗肌骨系统疾病(如肌少-骨质疏松症)的有效方式[3]。研究认为，除了对骨骼产生力学效应外，骨骼肌还可通过分泌白细胞介素-6(interleukin 6，IL-6)和鸢尾素等“肌肉因子”影响骨代谢[4]。然而迄今为止，骨骼作用于肌肉的生理途径仍是一个全新的研究热点。Brotto等[5]提出，既然肌肉和骨骼作为两种联系紧密的器官，为什么肌肉-骨骼的关系是单向的，只有肌肉影响骨骼，反之则不然？如果骨骼能够分泌大量因子，为什么这些因子不能对肌肉产生影响甚至优化肌肉功能？

骨骼腔隙系统与血管系统相连，骨组织细胞可释放因子到血液循环，影响包括肌肉在内的其他组织器官功能。研究表明，骨钙素(osteocalcin，OCN)、无翅型MMTV整合位点家族成员3a(wingless MMTV integration site family member 3a，Wnt3a)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、机械生长因子(mechano growth facoors，MGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)和转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)等因子均可对肌肉功能进行调控(图1)。本文拟对骨骼源性因子与肌组织代谢之间的关系进行探讨，以全新的角度探究肌骨间的分子串扰，以期加深对肌骨系统的认识与理解，为探索肌骨疾病“一石二鸟”的病理学、药理学及运动干预方案提供新的依据。

图1 骨骼源性因子对骨骼肌的影响示意图[5-7]Fig.1 Schematic diagram of the effect of bone-derived factors on the skeletal muscle[5-7]

1 骨钙素

OCN是一种骨特异性非胶原蛋白，在骨骼系统中发挥重要作用。一方面作为骨矿化的调节剂，另一方面通过调节成骨细胞和破骨细胞活性来调控骨代谢[8]。OCN可分为羧化完全骨钙素(carboxylated osteocalcin，cOCN)和羧化不全骨钙素(uncarboxylated osteocalcin，uOCN)。其中，uOCN可进入循环激活包括胰腺、脑和睾丸等多组织生物学功能[9]。最新研究发现，骨骼肌也是uOCN的靶器官之一，uOCN可通过其特定的G蛋白偶联受体C家族6组A亚型(GPRC6A)，促进肌细胞生长并增加肌纤维强度[10-14]。在动物模型实验中，外源性uOCN的补充可增加小鼠趾长伸肌横截面积和抓握力，促进C2C12成肌细胞培养过程中肌管形成[13]。Mera等[15]研究提出，uOCN可增加老年鼠肌管中蛋白质合成，与健康对照相比，OCN-/-鼠表现出肌肉质量低和力量弱的特点。此外，人体实验数据显示，uOCN浓度过低会引发中老年女性的髋屈肌、髋外展肌和股四头肌力量不足[12]。

肌肉衰老常伴随着关键的肌肉细胞信号通路蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，即Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated kinase1/2，ERK1/2)的活化程度下降[16]。uOCN在C2C12成肌细胞中顺序激活PI3K /Akt和p38MAPK途径诱导成肌细胞增殖，激活GPRC6A/ERK1/2信号传导机制增强肌源性分化，GPRC6A缺失会抑制C2C12细胞中Akt、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和肌管中ERK1/2磷酸化，延缓肌细胞增殖与分化并下调MyHC表达[17]。此外，uOCN蛋白表达水平以肌肉类型特异性方式与mTORC1和叉头框转录因子(forkhead box O，FOXO)信号通路中若干因子的表达和活性密切相关。循环uOCN和GPRC6A水平降低可引起相关肌肉类型的肌萎缩，加大后肢固定作用对uOCN/GPRC6A/ERK以及uOCN/GPRC6A/单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)信号级联的影响[18]。

研究证实，OCN可间接调控骨骼肌糖脂代谢，发展肌肉耐力。肌纤维GPRC6A- / -小鼠运动能力低于对照鼠约30%，运动后全身最大耗氧量，离体肌纤维耗氧量和骨骼肌内ATP浓度相对较低[19-20]。环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)介导OCN调节肌管中葡萄糖摄取和肌纤维中糖酵解[21]。OCN信号活化可增强运动过程中肌糖原分解，诱导葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)向质膜转运[22]。通过这些组合功能，OCN可提供增强三羧酸循环进程所必需的碳原子，从而补充骨骼肌运动时所需ATP。此外，骨骼作用于肌肉引发的“前馈调节环”决定了机体的运动适应[19]。首先，OCN增强肌纤维中葡萄糖和脂肪酸的摄取及分解代谢；其次，在运动过程中，由OCN引发的肌肉IL-6分泌增加，又促进葡萄糖和脂肪酸产生；最后，IL-6可通过调节骨吸收，增加uOCN的释放。综上，外源性uOCN补充可作为肌肉减少症和骨骼肌功能紊乱的潜在治疗方法，OCN介导的运动干预机制能够有效缓解老年人和体弱患者肌肉流失，维持其运动系统工作能力。

2 无翅型MMTV整合位点家族成员3a

Wnt3a是经典Wnt/β-catenin通路的重要配体，通过旁分泌、自分泌的方式释放于胞外结合细胞表面受体，以激活下游信号产生级联效应。研究鉴定了Wnt3a介导的成骨细胞反馈机制，在成骨细胞增殖或分化的早期阶段起促进作用，在成熟和矿化过程中起抑制作用。Wnt3a可上调Pdgfa、Cyr61和Tgfb3等早期成骨调节因子表达，下调Vdr和Rspo2等成熟和矿化的调节因子表达[23]。此外，Wnt3a还可阻断c-Fos表达减弱核因子KB受体活化因子配体(receptor activator of NF-KB ligand，RANKL)驱动的破骨细胞生成，逆转骨髓细胞响应RANKL升高的β-catenin磷酸化水平，并且还原RANKL诱导的Trap和Oscar等破骨细胞标记基因表达[24-25]。

研究表明，骨骼分泌Wnt3a受机械应力调控，继而向肌细胞发出信号。骨细胞样MLO-Y4细胞条件培养基(conditioned medium，CM)能够使比目鱼肌收缩力增加约25%，而CM内特异性抑制Wnt3a则显著减弱了这种影响。Wnt3a可通过激活Wnt、Notch和信号传导及转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)等信号通路调节C2C12成肌细胞分化[26]。Ridgeway等[27]研究显示，Wnt3a可激活MyoD和Myogenin等肌源性调节因子，并刺激β-catenin易位至C2C12肌细胞核，促进肌源性标志物MyoG、MHC和β-catenin途径下游基因过表达。此外，骨源性Wnt3a作为调节肌组织细胞内Ca2+信号和Wnt/β- catenin途径的重要媒介，还参与调控细胞内Ca2 +稳态作为增强肌肉收缩力的触发机制，诱导肌质网(sarcoplasmic reticulum，SR)钙释放、SR钙吸收和存储钙进入成肌细胞分化进程，并上调对肌管稳态和细胞肥大起关键作用的Ca2+信号基因(CamkII、Nfatc3和Srf)以及与线粒体生物合成和氧化应激反应相关基因(Pgc1α和Sod1)的表达[26]。相关研究还表明，Wnt3a具有促进大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)扩增的能力[28]。一方面，Wnt3a可诱导β-catenin核转位并激活BMSCs中Wnt通路，加快细胞增殖并保持分化潜力；另一方面，Wnt3a可通过下调CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein α，C/EBPα)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)的表达抑制BMSCs成脂分化[29]。Wnt3a信号介导BMSCs肌源性分化，为人类基于细胞水平的组织修复提供合理的理论基础。

3 前列腺素E2

PGE2是一种内源性脂质介质，由花生四烯酸在磷脂酶、环氧合酶和前列腺素E合成酶作用下代谢产生。骨骼系统中，PGE2可参与调节成骨细胞及其前体细胞、破骨细胞和骨细胞功能及细胞间通讯[30-31]。PGE2通过激活p38MAPK、p44/p42 MAPK和应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)/c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)，在成骨细胞样MC3T3-E1细胞中刺激骨保护素(osteoprotegerin，OPG)合成，促进骨形成[32]。另有研究发现，PGE2可刺激RANKL产生，以环磷酸腺苷(cyclic Adenosine monophosphate，cAMP)依赖性方式抑制成骨细胞中OPG的产生[33-34]。上述结果可能源于骨组织细胞内4种G蛋白偶联受体亚型(EP1、EP2、EP3、EP4)通过不同的途径发出信号，引起PGE2在骨骼中发挥双向功能[35]。

骨源性PGE2主要结合EP4调控骨骼肌代谢，Mo等[36]实验研究显示，PGE2可诱导肌源性分化引起，MyoD和MyoG等转录调节因子表达上调。此外，PGE2结合EP4可加速细胞周期中G1-S相变以促进原代成肌细胞增殖，并作为骨骼肌中氧化应激调节剂，减少EP4诱发的成肌细胞活性氧产生。近期研究表明，成骨细胞和骨细胞中间隙连接蛋白43(connexin 43，Cx43)缺失会导致体内肌纤维形成受损，而机械应力增加骨细胞中PGE2释放，可激活cAMP/激酶A(protein kinase A，PKA)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/Akt途径，诱导糖原合成酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK-3)磷酸化和失活，β-catenin核转位增加[11]。细胞核中β-catenin参与Cx43启动子调控，上调Cx43 mRNA表达，逆转由Cx43缺失引起的肌组织损伤[30]。另有研究发现，肌肉损伤引发系列炎症反应，PGE2作为炎症细胞因子，可结合EP4直接靶向肌组织，引起肌肉扩张，在许多病理性疾病如肌肉萎缩、肌肉营养不良中具有显著意义[37-38]。骨细胞中PGE2分泌量比肌肉细胞多1 000倍，超生理水平的PGE2作用于损伤的肌肉，可促进骨骼肌的重塑和修复[39]。值得关注的是，骨骼肌中还存在一种静止的肌肉特异性干细胞(muscle specific stem cells，MuSCs)，可在整个生命过程进行组织再生，而MuSCs中EP4特异性遗传消融将会间断PGE2信号传导，阻止此进程以导致肌力下降。PGE2和EP4相互作用可通过激活诱导增殖的转录因子NURR1的cAMP/phosphor-CREB途径引起MuSCs扩增。由此，PGE2信号转导能够作为肌肉干细胞功能的“变阻器”。PGE2由骨细胞合成并分泌到干细胞生态位中以响应损伤，诱发MuSCs增殖，是肌纤维受损后修复的关键步骤[40]。

4 其他因子

离体实验研究显示，流动流体剪切应力可增加骨细胞样MLO-Y4细胞分泌IGF-1、MGF、VEGF和HGF等因子[41]。IGF-1是骨基质中最丰富的生长因子，在成年期参与维持骨量。Xian等[42]报道，骨重建期间从骨基质释放的IGF-1可激活mTOR刺激募集的MSCs向成骨细胞分化，以维持适当的骨微结构和质量。进入血液循环后，IGF-1还能够促进成肌细胞增殖和分化，在机体发育过程中作为调节肌肉量的重要因子。骨骼肌中IGF-1信号传导下游Akt活化会引发快速且显著的肌肉肥大效应，绝对力量增加[43]。MGF作为IGF-1的剪接变构体和局部自分泌的生长因子，可通过延长细胞周期的G1期，在特异性培养基诱导期间增强BMSCs成骨分化。骨骼肌损伤后，MGF先于卫星细胞激活发生，同时促进卫星细胞增殖[44]。研究表明，BMSCs通过旁分泌释放VEGF刺激成肌细胞增殖。Sassoli等[45]向C2C12细胞中添加MSCs衍生CM可增强VEGFR磷酸化并提高其表达水平，而KRN633(VEGFR抑制剂)处理后导致受体活化显著减少，并减弱MSCs-CM对C2C12细胞生长和Motch-1(成肌细胞活化和增殖的关键决定因子)信号转导的影响。HGF在骨形成中发挥多重功能，参与维持骨再生，血管生成和成骨细胞与破骨细胞之间的平衡，不仅刺激成骨细胞分化并抑制矿化，也可刺激破骨细胞生成。而骨源性HGF快速释放可促进功能性肌肉组织的重塑并增强骨骼肌再生[46-47]。

自1988年鉴定BMP-2作为骨和软骨形成的有效诱导剂以来，BMP超家族信号成为脊椎动物骨骼生物学研究中最丰富的信号之一[48]。成骨细胞产生的BMP-2可自由分泌或结合到骨基质中，随后在破骨细胞介导的骨吸收过程中被释放。结构活跃的BMP信号能促进去神经支配后的肌肉肥大并减少肌肉萎缩。另有研究还阐明了BMP/Smad1、5、8信号转导在促进肌肉生长和维持成人肌肉力量中的重要作用[49- 50]。

骨组织中的TGF-β主要由骨细胞、成骨细胞和破骨细胞等通过自分泌和旁分泌途径合成。与引起骨骼肌肥大反应的骨衍生因子相反，骨骼在病理状态下会分泌过量TGF-β及其家族成员肌肉生长抑制素、活化素和生长转化因子-11，通过激活素受体2B发出信号，抑制肌肉功能[51-52]。尽管TGF-β和后者均导致肌肉功能障碍，但它们的模式却不同。腺相关病毒(adeno-associated viral vector，AAV)载体在肌肉中表达时，活化素会诱发全身性肌肉萎缩和恶病质。在活化素水平表达较高的肌组织中，存在严重的肌肉质量损失和峰值力降低，但比力值没有变化。相比之下，体内用TGF-β处理后肌肉质量并无变化，但其纤维化和横截面积降低，导致骨骼肌峰值力和比力值均降低[53]。Regan等[54]研究认为，Nox4/阿诺碱受体1(ryanodine receptor 1，RyR1)信号轴参与骨基质释放的TGF-β引发RyR1氧化应激和骨骼肌内Ca2+稳态失衡，严重影响肌肉功能。

表1骨骼源性因子介导的骨骼肌生理进程与功能

Table1Physiological processes and functions of the skeletal muscle mediated by bone-derived factors

骨骼源性因子参与的骨骼肌生理进程与功能OCN诱导成肌细胞增殖与分化;改善肌肉能量代谢;增强肌肉力量和耐力Wnt3a诱导肌源性分化;调节氧化应激PGE2减轻炎症反应;修复肌纤维损伤IGF-1诱导成肌细胞增殖与分化;增强肌肉力量MGF促进肌卫星细胞增殖VEGF促进成肌细胞增殖HGF增加肌肉重塑和再生BMP-2加快肌肉生长;维持肌肉力量TGF-β降低肌肉功能

5 小结与展望

肌肉与骨骼同属运动系统两大器官，在维持人体健康中的作用不容忽视。骨源性OCN等对骨骼肌代谢的正向调控包括：①促进成肌细胞增殖，诱导肌源性分化；②维持骨骼肌力量素质，减少氧化应激，增强肌骨系统运动适应性；③提高肌肉组织损伤后再生和重塑能力，加速肌组织修复(表1)。然而，在病理学状态下，肌组织微环境中的骨骼源性TGF-β增加，会损害骨骼肌。骨质疏松患者体内骨重构失衡，引发多种骨骼源性因子分泌异常，潜在地影响肌组织结构与功能，降低肌肉质量。未来研究亟待解决如下问题：首先，多数骨骼源性因子能够改善肌肉功能，但其发挥作用的最佳剂量尚无定论；其次，不同骨骼源性因子在肌组织代谢调控中是否存在交互效应甚至于相互制约的影响尚不明晰；再次，骨硬化蛋白等因子可制约骨骼肌发展[6]，采取何种手段抑制其介导的肌骨间交流途径尚不确定；最后，运动干预可直接刺激肌骨系统，延缓肌肉衰减和骨质疏松的发生，但运动对骨骼源性因子的调节效果尚不知晓。建议下一步以骨骼为作用靶点，继续探寻骨骼源性因子在肌骨系统中的作用机理，力求同时提高骨骼和肌肉的强度和功能，为降低肌骨疾病的发生提供新的着力点。